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尘螨致敏小鼠肺部变应性炎症模型的建立  

2015-12-15 16:40:06|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西根据客户的需求提供各种有效的炎症疾病模型和免疫性疾病动物模型,用来检测药物的有效性。常规的炎症和免疫性疾病有:急性炎症、关节炎、实验性过敏性脑脊髓炎等,通过大小鼠进行动物实验。

(联系我们:www.medicilon.com.cn Email:marketing@medicilon.com.cn

[ ] 目的 :研究使用尘螨提取液构建 BALB/ c 小鼠肺部变应性炎症模型的方法。方法 : 加强致敏/ 激发组(加强组) 用尘螨提取液腹腔(1 d) 和皮下注射(8d) ,用提取液多次滴鼻激发(14 - 16 d) 。最后一次滴鼻6 h后对小鼠作肺泡灌洗。单剂量组则于第1d腹腔注射1 ,14 d 滴鼻1(剂量同加强组) 。对照组用 PBS作注射和滴药。进行灌洗液细胞计数和分类 ,肺组织病理计分 ,灌液洗用ELISA 测定IL-4IFN -γ含量。结果 :

① 强组肺部病理计分明显升高 ,病理改变呈明显变应性炎症 ;

② 加强组灌洗液中细胞计数和嗜酸细胞计数明显升高( P < 0105) ;

③ 加强组灌洗液 IL - 4 明显升高( P < 0105) ,IFN -γ无明显变化 ;

④ 单剂量组上述指标与对照组比较无显著差异。结论 : 使用多次的尘螨提取液致敏和激发的方法可成功诱导 BALB/ c 小鼠的肺部变应性炎症。

[关键词] 变应原 ;哮喘 ;炎症动物模型

哮喘的特征是气道的慢性变应性炎症 ,在其发 病因素中最重要的外因是变应原。目前还没有能够复制完全与人体哮喘相符的动物模型。大多数制作变应性炎症使用卵蛋白 (OVA) 、尘螨、豚草花粉和虫卵等。国内目前使用的多数是卵蛋白致敏的豚鼠哮喘模型 ,可以诱发速发相和迟发相的变态反应 ,容易致敏和产生气道炎症。但是 ,豚鼠缺乏有明确基因型的种系 ,也缺乏相关的免疫学和分子生物学试剂。尽管能产生很好的气道炎症动物模型 ,但对于进一步地深入研究免疫和遗传机制较为困难。因此 ,在实验中使用小鼠变应性疾病的模型越来越多。在致敏变应原的选择方面 ,由于尘螨是最常见的哮喘变应原 , 80%的哮喘患者对尘螨过敏 ,其在哮喘中的地位已 经确认。因此 ,采用尘螨诱发的哮喘模型能够更好地反映人体的哮喘情况。而目前 ,单纯模仿 Clarke等的方法并不能制出满意的小鼠肺变态反应模型。本研究使用尘螨的提取液致敏和激发 BALB/ c 小鼠 ,构建尘螨诱发的小鼠肺部变态反应性炎症的模型 ,为今后对于哮喘发病机制研究和探索新的治 疗手段打下基础。 材料和方法 1 主要试剂 111纯化尘螨提取液购自丹麦ALK公司 ,产品认证号 :N07311513N ,主要成分是 :Der p1 (48 %) Der p2 (49 %) , PBS 稀释为 1 g/ L 112 IL - 4 IFN -γ ELISA 检测试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司 2 动物分组 5 - 6 周雌性SPFBALB/ c 小鼠 ,体重 (20 ±2) g ,广州医学院动物中心提供。动物分为正常对照组 (以下简称对照组) ,单次激发组 (以下简称单剂量 ) 和加强激发组(以下简称加强组) 。对照组 7 , 单剂量组4 ,加强组 6 只。 3 致敏和激发步骤 单剂量组和加强组采用纯化的螨提取液致敏和 激发。加强组第 1 d ,腹腔注射含 2 %氢氧化铝的尘 螨提取液 50μL , 8 d ,皮下注射含 2 %氢氧化铝的 尘螨提取液 50μL , 141516 d ,每天用 0. 3 %戊巴 比妥 0. 3 mL 腹腔注射麻醉小鼠后 ,用尘螨提取液 50 μL/次缓慢滴鼻 ,每天 1 次。单剂量组参考 Clarke [1 ]的方案 ,在第 1 d 腹腔注射致敏 , 14 d 滴鼻 1 ,所用尘螨提取液量同加强组。对照组步骤同加 强组 ,但滴入和注射的是 50μLPBS。最后一天滴鼻 6 h 进行以下步骤。 4 支气管肺泡灌洗和取血 0. 3 %戊巴比妥 0. 3 mL 腹腔注射麻醉后 ,眼窝取 ,滴入肝素抗凝管内 ,离心 3 000 ×g 20 min ,血清 移至另一干净 Eppendorf , - 20 保存。气管内插 ,PBS 0. 3 mL/ ,灌洗 2 ,灌洗液回收率 > 80 % 5 灌洗液细胞涂片的制作、细胞计数和分类 肺泡灌洗液 (BALF) 离心 (800 r/ min) 10 min , 集的上清移至另一干净 Eppendorf 管中 , - 70 保存 , 准备测定 IL - 4 IFN -γ,细胞沉淀用 1 mL PBS ,取少许用于细胞计数 ,算出每毫升的细胞数。余液再次离心后弃上清 ,用少许 PBS 重悬后涂片 ,空气 中晾干后放于固定液(50 %乙醚和 50 %乙醇) 固定过 夜。次日 ,冲洗后常规 HE 染色 ,光学显微镜下进行 细胞分类 , 200 个细胞 ,求出百分比。用所得的细 胞总数乘以百分比即得各分类细胞的绝对计数。 6 肺的病理组织学检查 取小鼠右肺组织放入 10 %甲醛液固定过夜。常 规取材后 ,进行梯度酒精脱水 ,组织透明处理 ,浸蜡 , 石蜡包埋切片 ,HE 染色 ,光镜下观察肺组织嗜酸细 ( EOS) 浸润 ,水肿和气道上皮损伤情况 ,根据 Un2 derwood 的标准进行评分[2 ] 7 BALF 中的 IL - 4 IFN-γ含量的测定 冰冻保存的 BALF 上清放在冻干机内冻干 ,冻干 后用 200μL 生理盐水重新溶解 ,各取 100μL ,分别测 定其中IL - 4 IFN - γ的浓度 , ELISA 试剂盒说 明书进行测定。 8 统计学处理 数据用均数±标准差表示,病理计分采用中位数(全距) 表示 ,各组间均数比较采用 SPSS 软件进行 独立样本的t检验。

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