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上海美迪西生物医药有限公司成立于2004年,位于上海张江高科技园区和上海川沙经济园区,是一家综合性的生物医药研发服务公司。目前公司拥有30000 平方米的研发实验室和国内一流的仪器设备。公司科研中坚力量由几位经验丰富的华裔博士和在美国制药领域工作多年的企业管理人士组成。公司现有员工800余人,约50%拥有博士学位或硕士学位,超过10%的员工拥有国外教育背景和/或工作经验。

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亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用  

2015-12-22 11:20:33|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面有10余年经验积累,美迪西生物医药拥有多种蛋白表达协同,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为你在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系,以提高您的目的蛋白表达水平。(www.medicilon.com.cn 邮箱:marketing@medicilon.com.cn

摘要 亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具,具有结合特异性 高、洗脱条件温和、通用性强、纯化倍数高等显著优点。概述了亲和标签对融合蛋白表达的影响, 可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠;回顾了在重组蛋 白表达与纯化中广泛使用的几种亲和标签,以及近年来相继出现的几种比较新颖的纯化标签;介 绍了亲和标签的组合使用策略,His6MBP组合标签集合了两个标签的优点,串联亲和纯化可以纯 化获得生理条件下的蛋白质复合体;展望了亲和标签未来的发展趋势,认为仍需继续开发性能更加优越、纯化效果更加显著的纯化标签系统。 关键词 亲和标签 重组蛋白 融合表达 亲和纯化在结构蛋白质组学研究、蛋白质微阵列芯片技术 及重组功能性蛋白质生产中,必须首先获得大量高度纯化且正确折叠的蛋白质,以便后续对其结构、功能 及相互作用进行系统分析,实现功能性蛋白质产品的 商业化。然而,由于来源成分复杂、理化性质各异、结 构功能多样,蛋白质的纯化一直是结构蛋白质组学研 究与生物技术产品开发中的一个瓶颈问题,严重制约了后续的结构分析、功能验证和功能性蛋白质的产 品化。 生物物质,特别是酶和抗体等蛋白质,具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力。基于 生物分子间的这种特异性结合作用而形成的亲和纯化技术,已广泛应用于蛋白质,特别是重组蛋白的分离纯 化中。在重组蛋白的亲和纯化中,利用基因工程技术, 将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达,通过一步简单快速的亲和层析,直接获得纯度较高的重 组融合蛋白,已成为重组蛋白纯化的一个通用方法,具 有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点,为蛋白质的有效纯化提供了一条解 决的途径 ,广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。 1 亲和标签对融合蛋白的影响从蛋白质结构与功能的基础研究到功能性蛋白质表达与纯化工艺的开发,亲和标签已经成为重组蛋白纯化的一个重要且有效的工具。它们不仅便于对融合蛋白的检测与纯化,而且可能对目标蛋白的理化性质产生有利的影响,可以提高重组蛋白的产量,增强重 组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠。

1.1 提高重组蛋白的产量 在使用亲和标签进行融合表达的过程中发现,位于目标蛋白N端的某些亲和标签,如谷胱甘肽 转移 酶(glutathionestransferaseGST)、麦芽糖结合蛋白 MBP 、泛素(ubiquitinUb 、小泛素相关修饰蛋白(smallubiquitin related modiferSUMO 等,通常可以显著提高重组蛋白的产量。这些融合标签为高效的翻译起始提供了一个可 靠的位点,从而能使核糖体在标签N端的甲硫氨酸处有效地起始翻译,促使融合蛋白大量表达,提高蛋白产量。由于小范围内的RNA分子之间的相互作用比大范围内的 RNA分子之间的相互作用更倾向于稳定,融 合于目标蛋白 N端的小分子标签可能会导致不利二级结构的出现;如果融合蛋白mRNA的二级结构干扰了核糖体的结合,就有可能降低融合蛋白的表达量。 另一方面,位于目标蛋白N端或C端的某些特定 氨基酸序列会影响蛋白质自身的降解,而某些标签 能够耐受宿主内蛋白酶的降解。因此,在某些情况下, 亲和标签能使融合蛋白更耐受宿主内的蛋白酶降解,从而有可能提高重组蛋白的产量。然而,到目前为 止,亲和标签增加重组蛋白产量的机制仍不是很清楚。

1.2 增强重组蛋白的可溶性大肠杆菌由于具有遗传背景清楚、生长迅速、表达量高、使用方便等显著优势而成为 大量表达外源蛋白经常使用的表达宿主,但同时也存 在着真核蛋白表达成功率低、不能进行大多数翻译后 修饰等明显不足;特别是大量的表达实验发现,在大 肠杆菌中大量表达的所有重组蛋白中,有超过一半的产物以包涵体的形式聚集在一起,可溶性很低,极大地限制了重组蛋白的大规模生产。使用真核表达系 统,例如酵母表达系统、昆虫杆状病毒表达系统,或者 无细胞蛋白合成系统可以解决重组蛋白的可溶性问题,却由于缺乏对它们的系统研究,大肠杆菌仍是目前 外源表达系统的优先选择。 为了抑制大肠杆菌所表达的重组蛋白形成包涵 体,包括选用特定的表达菌株 、与分子伴侣共表达 、降低目标蛋白的表达温度 、调整诱导剂浓度等在内的一系列方法已经用于提高所表达重组蛋 白的可溶性,却并不总是有效。研究发现,在融合亲和 标签进行原核表达的过程中,某些高度可溶的蛋白标 签具有提高融合蛋白可溶性的能力,如GST MBP SUMO NusA 等,其中研究最透彻、阐述最清楚的增强融合蛋白可溶 性的标签有 MBP NUSAMBP是一个由396个氨基 酸组成、大小约为40kDa的蛋白标签,具有很高的可溶 性,与目标蛋白融合后,可以有效地增大融合蛋白的可 溶性。通过改变 MBP“开放”与“关闭”构象之间的平 衡后发现,这种突变很显著地影响 MBP提高融合蛋白 可溶性的能力,表明它的助溶性是由自身的“开放”构 象介导的。Nusa是一个由495个氨基酸组成、大小 约为 55KDA的蛋白标签,自身内在的可溶性很高,与目 标蛋白融合后,能够有效地提高重组蛋白的可溶性和 稳定性,蛋白表达量也相应地增加。然而,与增大可溶性标签融合后,并不是每一个融 合蛋白的可溶性都会提高,有些蛋白在融合标签去除 后仍会形成不溶性聚集体;同时,某些可溶性标签增大 融合蛋白溶解能力的机制仍然知之甚少。一种模型认为,融合蛋白形成了一个可溶性类微团的多蛋白结 构,易聚集的目标蛋白在这个结构的里面,远离溶剂, 而亲水的标签结构域面向外部;这些蛋白颗粒并不大, 因而在低速离心时不会沉积下来。另一种模型认 为,在融合蛋白中,高度可溶的蛋白标签自身具有内 在的类分子伴侣活性,部分折叠的目标蛋白与融合标 签的疏水区之间短暂反复的相互作用阻止了它们的自 聚集,从而引导融合蛋白形成原始的结构;融合标签可 能只是减少了无益的旁路聚合,在目标蛋白的折叠中 并没有起主要作用。 蛋白表达与纯化

1.3促进重组蛋白的正确折叠 在利用亲和标签增大重组蛋白可溶性的同时发 现,某些高度可溶的蛋白标签具有促进目标蛋白正确 力,如 MBP 、NusA 、硫 thioredoxin,Trx)等。一般而言,蛋白质是否能够 正确折叠,主要取决于其自身的氨基酸序列,因而这些 亲和标签只是协助目标蛋白进行正确折叠,而不能决 定其是否正确折叠。一种观点认为,增大可溶性的蛋 白标签促进目标蛋白正确折叠的能力存在着明显的差 异,表明这些蛋白标签在目标蛋白的折叠过程中发挥 主动作用。另一种观点认为,目标蛋白的折叠效果主 要依赖于蛋白自身,而不是这些增大可溶性的蛋白标 签,表明这些可溶性很高的蛋白标签在目标蛋白的折 叠过程中只发挥被动作用;尽管不能确定目标蛋白的 哪一部分被正确折叠,但这类标签可能具有相似的作 用机理,目标蛋白的相同部分被正确折叠。第三种观 点认为,上述两种观点均不成立,目标蛋白最合适的标 签必须通过实验验证来从众多的可溶性很高的亲和标 签中确定最佳选择。 除了上述有利影响之外,亲和标签还可能抑制融 合蛋白的水解、保护融合蛋白的抗原性、提高融合蛋白 结合分析的敏感性等。当然,亲和标签也可能会给目 标蛋白带来不利影响,改变蛋白质的构象、促使蛋白质 自联、抑制酶活、改变蛋白质的生物活性等,因而在选 择亲和标签时必须注意这些问题。

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