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上海美迪西生物医药有限公司成立于2004年,位于上海张江高科技园区和上海川沙经济园区,是一家综合性的生物医药研发服务公司。目前公司拥有30000 平方米的研发实验室和国内一流的仪器设备。公司科研中坚力量由几位经验丰富的华裔博士和在美国制药领域工作多年的企业管理人士组成。公司现有员工800余人,约50%拥有博士学位或硕士学位,超过10%的员工拥有国外教育背景和/或工作经验。

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蛋白质的化学合成  

2015-12-29 14:43:18|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西作为全球化学服务领域的领导者,我们有一支强大的分析化学团队支持合成化学服务。我们致力于通过多产,快速,解决问题和积极沟通为顾客提供最高质量和最大价值的产品和服务。我们的团队受过极好的专业训练,与客户保持密切联系和互动,及时沟通保证项目顺利进行,并一致努力去实现客户指定的项目目标。在FTE的服务模式中,我们为客户的目标分子设计合成路线,并按时按质按量完成化合物的合成并交付。这些化合物包括对照化合物、代谢物、试剂、中间体、分子片段和杂质等。(联系我们:marketing@medicilon.com.cn www.medicilon.com.cn

蛋白质是生物体中功能最重要的一类生物大分子,目前 蛋白质的制备方法主要有3种:生化提取法、基凶T程法和 化学合成法“]。各种方法利弊并存”叫],没有一种方法能够 完全适用于所有蛋白质的制备。生化提取法来源少,基因工 程法翻译后难以修饰.易形成包合体等不恰当的折叠构型; 相比之下,化学合成法提供了一条快速、高效的蛋白质制备 途径,同时它能方便地引入非天然氨基酸,政变碳链骨架以 及其他化学修饰来提高蛋白质活性,构建新蛋白。经过30 多年的发展,蛋白质的化学合成取得巨大的进步,逐步合成 法、片段组合法、化学选择性连接作用、非共价定向拼接的 依次出现.大大推动了蛋白质化学合成向纵深方向发展。蛋 白质的全合成不仅具有重要的理沦意义,而乍L具有相当重要 的应用价值。 1 两种氨基保护策略 目前应用在化学合成上主要有两种方法:Boc(叔丁氧 羰基)口一“传统固相法和Fmoc(芴甲氧羰基)口”新型固相 法。Boc化学合成法是一种历史较长也较成熟的方法。相比 之下,Fmoc法历史较短,但具有条件温和、副反应少、产 率高、操作简便等优点,其优越性止在逐渐为人们所认识, 已被广泛应用于柞种活性分了的合成。Fmoc法最大的优点 是不需要采用剧毒的氢氟酸将日标蛋白从固相载体上裂解下 来并脱除侧链保护基,而是采用三氟乙酸水苯酚二巯基乙 烷苯甲硫醚(82555525)定量地从树脂上切除, 避免了采用强酸如液态氟化氢可能产生的氨基酰化等副 反应。 2蛋白质化学合成的基本方法 21 逐步合成法E4,s-r] 逐步合成法是最早发展起来的化学合成蛋白质的方法. 它的基本原理是根据目标蛋白的氨基酸序列(‘级结构) C端.(N)依次逐个偶联各个氨基酸柬合成蛋白质。 逐步合成最大的特点是简单明了,但是它合成蛋白质的能力 高度依赖于各步的合成效率。 最近4年来,本实验室对胸腺素衄和扶素康的逐步化 学合成进行了大量的研究“~…。特别是对胸腺素劬,系统研 究了不同的缩台试剂,包括IxcD1CHBTUHATU 对合成速度和产物质量的影响,为胸腺素n,的进一步产业 化提供了依据。 数十年来,化学合成取得了可喜的进步,但是,合成速度一直是摆在人们面前的一个严峻挑战,特别是合成那些由 上百个氨基酸组成的目标分子。一般地,根据保护方法和偶 联策略的不同,每个氢基酸的偶联需要201 20 rain,如果 是“困难序列’’。-1的合成,那就需要2倍甚至3倍的偶联时 间,才能达到可以接受的酰化产率。快速合成法“”1的出 现,满足r人们一直所追求的偶联10--15个氨基酸·h“的 日标。固相载体卜的快速合成由脱保护、排空、冲洗偶联的 重复循环过程组成(见罔1)。由图l可见,整个循环时间 不到5 min,一直重复该循环直到合成完目标分子。成功地 高产率合成“困难片段”ACP(1015)PnlA(A10L) PR(8199),平均产率分别为992%、994%和 979蹦”一,证明了该方法的快速性和有效性。总的米说, 快速合戚法具有以下几方面的优点:①快速鉴定目标分子的 “困难序列”;②快速台成小而复杂的肽;③快速合成蛋fE_i 及其突变体,以便于短期内对结构功能关系进行更深入的 研究;④快速合成用于化学选择性连接构建目标蛋白的肽 片段。 尽管快速合成法的效果十分显著。但是仍有几个方面的 问题限制了它的广泛应用:①HATU价格昂贵;②还无法 有效将快速HATUBoc原位中和偶联应用到自动合成仪 中。因此,将来很有必要进一步发展比HATU更加便宜有 效的替代偶联试剂和研究设计适用于快速合成法的新一代自 动合成仪。 22 片段组台法口71 虽然固相多肽合成(solid phase peptide synthesis SPPS)与经典的液相法相比具有许多优越性,但固相法也 有其不可避免的问题存在,即延伸反应过程中形成的各种副 产物住目标分子l:的累积,这就给目标分子的分离纯化带来了不少困难,从而限制J7固相法在合成长序列目标分子领域 的应用。完全保护片段组合法综合应用固、液相合成法的优 势。它的基本策略是,固相合成出来的几个小片段纯化以 后,再在溶液中(或固相载体上)组合成需要的蛋白质。根 据片段组合场所的不同,分别称为液相片段组台和固相片段 组合(见图2)。片段组合的主要步骤为:①片段的设汁与 合成;②片段组合。 221 片段的设计与合成对于片段组合而言,可将整个 目标序列分为大约由10个氢基酸残基组成的片段,如果C 端或N端的氨慕酸需要和其他片段发生偶联反应,那就要 选用特定的氨基酸。末端残幕的选择是十分必要的,正确的 选择能保证反应的快速进行.从而降低反应过程中的消旋作 用和副产物的生成。经过理论推导千u实验验证,Shumpei SakakibaradL“一对末端氨基酸的选择作出r富有参考价值的 成果。 在化学合成过程中,影响产物质量的幽素是多种多样 的。偶联试剂是其中一个较为重要的影响因素。对于单一的 偶联试剂F)(TC,反应过程中产生r多种副产物,包括消旋 化和过度活化等产生的不利后果。针对偶联试剂,改进的措 施是加人辅助性亲和西刹。如l羟基苯并三唑(HOBt) N羟基琥珀酰亚胺(HONSu).这雌化合物易与过分活泼的 中间体(()乙酰基脲)反应,生成害处小、活性充分的酰化 剂.从而抑制消旋化和副产物的生成。但是这种趋势仍然依 赖于片段的序列。评价一个氨基酸能否作为术端残基的关键 在于它是否具有空间位阻结构。是否会发生B消去反应。 222 片段组合片段的偶联既可以在液相中进行,也可 在固相载体上进行,相应地分别称为液相片段组合和固相片 段组合(见图2)。对于液相片段组合法而言,由于所用的 肽片段是完全保护的,因而溶解性差就成为液相片段组合法 中最为棘手的问题.特别是随着片段的延伸.问题就显得更 加突出。为r解决这恫题,就需要寻找比常规溶剂DMF DMSO(二『_l基亚砒)更有效的溶剂,或者采丌丁固相组合 法。全氟醇如HFIP(六氟异丙醇)TFE(二氟乙醇)便 是溶解能力极强的溶剂.但这又会J托生新的问题,那就是难以控制该试剂的高亲核性。采用混台溶剂的形式跚,如 CHITFE(氯仿三氟乙醇)CHL HFlP(氯仿六氟异 丙醇),币仅性能比DMFDMSO优越得多,而且亲核性过 高的问题也得到有效控制,并成功用于绿色荧光蛋白 GFpL。、人类肝索结合性生长因子””等的化学合成。同时, 也可以从另一个角度出发来解决完全保护片段溶解性差的问 题,将片段的偶联从液相转移到固相载体上,采用固相组合 的方法。两者相比,【司相组合法币仅减少了完全保护片段/ rrl间产物的溶解性和聚集性问题,而且简化r实验操作,比 液相组合法更有实际应用价值,固相组合法已成功地用于} 淀粉蛋白、r玉米蛋白N端等的化学合成旷。 片段组合法的优势是明显的,但是它所存在的问题也是 不容忽视的。问题主要有眦r儿点:①片段需要完全保护, 操作复杂,同时造成片段在液相色谱纯化的水溶剂和偶联反 应盼有机溶剂中溶解性降低;②片段偶联速率较低,需增加 偶联时问来提高片段偶联率;③片段C端残基在偶联过程 中可能广:生消旋。

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