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骨髓涂片评价在药物安全性评价中的操作流程  

2015-12-07 11:14:49|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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我们在药物安全性评价方面有专业的团队和实战经验,可提供高质量的数据和快速的周转期以支持各项药物安全评价研究。毒理学研究在不同的动物种类中开展,从剂量设计,实验研究到组织学和病理学研究包括临床检测均可按照非GLP或者GLP标准执行。我们的研究平台已被评为上海研发公共服务平台。

联系我们(www.medicilon.com.cn 邮箱:02158591500)

要:药物临床前安全性评价是在药物上市前保证药物安全的一个重要的环节,而其中一个主要目标是为了找出潜在的毒 性靶器官以及研究毒性是否可逆。由于造血系统常常会受到药物的影响,所以骨髓涂片评价也是在药物安全性评价中评估 物对造血系统影响的一个重要的组成部分,对常规骨髓涂片的操作过程以及重要性进行综述。

关键词:骨髓涂片;评价;样本采集;实验动物

药物临床前安全性评价,是指通过一系列的实 验研究来判断药物对机体的不良反应和影响,从而 为药物的安全性提供全面、准确和严谨的实验数据。 为了能够可靠地评估药物实体的安全,往往需要通 过遵守良好实验室规范(GLP)的实验室来进行药 理学和毒理学实验。毒理学实验中的一项重要内容 是推测受试药物的临床毒性靶器官、靶组织及其毒 性特征。由于造血系统常常是药物实体暴露的潜在 靶器官,而骨髓是机体最重要的造血器官及负责产 生红细胞、粒细胞、淋巴细胞和血小板的中枢淋巴器官,药物可能会特异性地影响到骨髓细胞的类 型或非特异性地影响其细胞增殖、分化,所以如果 外周血检查出现无法解释的异常时,需要对骨髓进行药物安全评价研究。通过对骨髓涂片进行细胞学检查来判断 药物潜在的血液毒性以及对造血系统的影响。现在 也有通过流式细胞技术、电镜技术等对骨髓细 胞某些方面进行更为详细的评价。本文仅介绍目前 广泛使用的常规骨髓涂片的整个操作及评价流程。

1 骨髓样本采集 骨髓样本采集通常都是在实验动物被麻醉或者 处死的情况下进行的。从骨髓样本采集的角度来讲,要获取最理想的骨髓标本,在剖检取材时,应该首 先采集骨髓,因为动物被处死后骨髓样本很快会凝 结成块状,并且开始出现自溶现象。在动物被处死 5 min 之内采集骨髓样本,细胞形态学最理想。 当然,每个实验室都可以根据自己的情况在保证骨 髓样本质量的前提下进行调整。

1.1 啮齿类动物 对于啮齿类动物,常见的采集部位是股骨或者 胸骨,需要注意的是,股骨需要进行纵切采集才能 够观察到骨髓样本的状态及采集的质量。

1.2 非啮齿类动物 对于一些非啮齿类动物(如狗、猴、兔子等)的 采集部位,有些观点认为采集部位一般是胸骨或者 肋骨,而如果采集部位是股骨,会出现采集时间过 长及电锯产生热量是否会对骨髓细胞产生影响等问题。有些观点则认为通过股骨采集骨髓,涂片质量 仍然是令人满意的。 由于骨髓涂片的样本质量会受到多方面的影 响,很难在相同的客观条件下对因为采集部位的不 同而使样本质量发生变化的论点进行实验论证。所 以通常情况下,只要能够保证骨髓涂片的样本质量, 采集部位无论是胸骨、肋骨还是股骨,都是可以的。

2 骨髓涂片制备 骨髓涂片的制备方法是通过不断的实践经验得 来的,每一个实验室都可以根据自己的实验技术以 及实践经验在能够保证骨髓涂片质量的前提下选择 不同的制备方法。需要注意的是,在制备过程中, 过多或过少的稀释液(血清)不仅会影响整个后续 涂片的操作过程,而且对最后的读片也会产生影响。

2.1 人工骨髓涂片制备

2.1.1 大鼠骨髓(股骨)涂片制备 在干净的玻片 一端滴一滴大鼠血清或者胎牛血清,然后摘取完整 的大鼠股骨,用骨剪从膝关节向髋关节处纵剖,使 骨髓暴露并记录骨髓颜色及状态;用尖头镊子将骨 髓左右混合均匀后取出少量骨髓,最后将其与置放 在玻片上的血清混匀。然后取出另一片干净的玻片 作为推片,与玻片形成 3060°夹角(骨髓液较浓 时角度要小些,骨髓液较稀时角度要大些),由一侧 向另一侧用力均匀地推出,标本制作完成后应尽快 使之干燥。

2.1.2 犬骨髓涂片制备(胸骨/股骨) 在干净的玻 片一端滴一滴狗血清,如果采用胸骨作为取材部位, 则需要用剪刀沿肋骨的软硬肋连接线内侧大约 1 cm 处,从肋弓到第二肋骨,将左右肋骨剪断,取出胸骨, 用手术刀片从两节胸骨的软骨接缝处取第四或第五 胸骨,并将胸骨纵剖,暴露胸骨骨髓并记录骨髓颜 色及状态;如果采用股骨作为取材部位,则需完整摘 取股骨并用电锯从膝关节横向斩断,使骨髓腔暴露 并记录骨髓颜色及状态。然后用尖头镊子将骨髓左 右混合均匀后取出少量骨髓,最后将其与置放在玻 片上的血清混匀;取出另一片干净的玻片作为推片, 与玻片形成 3060°夹角(骨髓液较浓时角度要小 些,骨髓液较稀时角度要大些),由一侧向另一侧用 力均匀地推出,标本制作完成后应尽快使之干燥。

2.2 离心涂片机骨髓涂片制备

2.2.1 大鼠骨髓(股骨)涂片制备 摘取完整大鼠 股骨,用骨剪从膝关节向髋关节处纵剖,使骨髓暴露, 用尖头镊子将骨髓左右混合均匀,用镊子尖部取出 骨髓约 0.5 mm3放入事先装入 1.52 mL 血清(胎牛 血清或同种动物血清)的试管中。再用尖头玻璃滴 管反复吹打 30 次左右抽吸混有骨髓的血清,使骨髓均。将骨髓液用微量加样枪取 3050 μL(视所取骨 髓量而定)加入细胞离心涂片机的小漏斗中,以 600800 r/min 中速离心 10 min,取出载玻片,标本 制作完成。 2.2.2 犬骨髓(股骨)涂片制备 犬完整摘取股骨 并用电锯从膝关节横向斩断,使骨髓腔暴露;用 2 mL 注射器配 18 G×70 mm 针头轻轻吸取出少量骨髓约 0.52 mL,放入事先装入 1.52 mL 血清(胎牛血清 或同种动物血清)的试管中,再用尖头玻璃滴管反复吹打30次左右抽吸混有骨髓的血清,使骨髓均匀分散其中,注意尽量不要将血清吹打出气泡。将骨 髓液用微量加样枪取 3050 μL(视所取骨髓量而 定)加入细胞离心涂片机的小漏斗中,以 600800 r/min 中速离心 10 min,取出载玻片,标本制作完成。3 骨髓涂片染色 骨髓涂片染色在整个操作过程中方法比较统 一,但是各个染色方法的侧重点又有所不同,瑞氏 Wright)染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适 中,细胞核结构和色泽清晰艳丽,对核结构的识别 较佳,但对胞浆着色偏酸,色泽偏红,对细胞浆内 颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差;姬姆萨(Giemsa)染色的染料配方浓度对胞浆着色能 力较强,能较好的显示胞浆的嗜碱性程度,特别对 嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰,色泽纯正,而对胞核着色偏深,核结构显示较差;瑞氏- 姬姆萨混合染色则兼顾以上两个染色剂的特点,目 前已经开始广泛使用。但无论采用哪种染色方法, 都需要注意以下两个问题,一是如果涂片制备完成 需要一段时间以后再进行染色,那么在涂片制备完 成并晾干后,需要用无水甲醇固定涂片 12 min 二是在对涂片进行染色时,缓冲液稀释度越大,染色时间越长,细胞着色较为均匀;反之,稀释度越 小,染色时间越短,细胞着色较深,但不鲜艳。 3.1 Wright 染色 将标本涂片平放在染色架上,滴瑞氏染液于涂 片上,用滴管将染液荡散,直至布满整个玻片为止 (染液量要充足),等待 12 min,用配好的缓冲液 进行稀释,染液与缓冲液的比例在 1214,染 色时间通常在 1030 min,但仍需要视何种标本, 涂膜厚薄,有核细胞多少及何种细胞而定。最后直接用自来水冲洗,但水冲力不可太大,以防止脱色 或涂膜脱落。 3.2 Geimsa 染色 将标本涂片用无水甲醇固定 23 min,再置于 稀释过的染液(10 mL 水加入 1 mL 染液)中,染 1020 min,取出涂片并用水冲洗,置空气中自 行干燥即可。 3.3 Wright-Geimsa 染色 将标本涂片用 Wright 染液充分覆盖,并静置 12 min 后,将骨标本涂片移至 5% Giemsa 染液中, 轻振后静置 20 min 左右,最后取出涂片并用水冲 洗,置空气中自行干燥。 4 骨髓涂片评价 骨髓涂片的评价必须建立在涂片品质优良的前 提下,尽可能防止由于人为操作而导致涂片不能客 观反应动物本身所应有的生理学状态。骨髓涂片首 先应该在低倍镜下观察并确定涂片的涂膜厚度、着 色程度以及合适的区域,然后在油镜下对骨髓细胞 进行形态学的详细分类及评估。比较良好的骨髓 涂片应该涂膜厚度适中,着色红、蓝分明,含有核 细胞多,涂片尾部有造血岛、大细胞或油滴。油镜 下在合适的区域内应该由上到下或由下到上,由涂 片头部向涂片尾部迂回渐进,分类计数各类有核细 300500 个,并计算出其中各个系统各个阶段 有核细胞所占百分数、粒细胞系统各阶段有核细胞 总和数、红细胞系统各阶段有核细胞总和数、粒红 两系有核细胞的比例。 在观察分类计数过程中,应对各个系统进行详 细观察。 4.1 粒细胞系统 观察核形、成熟度(有无分叶过多、核出芽、 核松散、核溶解、畸形、Pelger 形核等)、颗粒有无 异常(有无中毒性黑褐色大颗粒等)、胞浆反应(有 无空泡、吞噬物等)、细胞大小(有无巨幼样变、巨 大分叶核等)。 4.2 红细胞系统 观察核形、成熟度(有无核固缩、核碎裂等)、 胞浆反应、有无巨大(无核)红细胞。 单核和淋巴细胞系统:观察有无幼稚细胞及形 态、体积大小是否异常。 4.3 巨核细胞系统 在低倍镜下计数,在油镜下确认属于何种阶段, 核形、成熟度(固缩、分叶)及周围有无血小板并 分类计数。

4.4 浆细胞系统 观察有无幼稚细胞及形态、体积大小是否异常。 胞浆是否异常(有无桑椹形、散珠形、葡萄状、火 焰状等)

4.5 非造血细胞 如果非造血细胞(各种组织细胞,退化细胞、 纤维细胞、网状细胞等)过多,需要进行记录并分 析是否是骨髓造血出现问题。

6 结语 骨髓涂片评价是在对骨髓进行评估时的一个不可被其他检查所替代的重要组成部分,要想从骨髓 涂片中得到客观真实的数据,减少在操作过程中的 各种人为因素是必要的。当然在临床前评价中,血液学检查和骨髓组织学检查仍然是基础,但任何一种单一的检查方法都不能对骨髓造血系统做出完整 的评估。近年来国外有通过应用流式细胞技术来参与到对骨髓细胞进行评价的例子,可是由于目前的技术并不是很容易精确区分对啮齿类动物某些细胞 系的分类,而且某些骨髓细胞细微的形态学上的改变必须通过人工镜检来进行辨别。所以到目前为止,在对骨髓细胞进行形态学判断时,骨髓涂片评价仍然是能够比较客观反映骨髓造血系统变化的一个重要方法。

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