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上海美迪西生物医药有限公司成立于2004年,位于上海张江高科技园区和上海川沙经济园区,是一家综合性的生物医药研发服务公司。目前公司拥有30000 平方米的研发实验室和国内一流的仪器设备。公司科研中坚力量由几位经验丰富的华裔博士和在美国制药领域工作多年的企业管理人士组成。公司现有员工800余人,约50%拥有博士学位或硕士学位,超过10%的员工拥有国外教育背景和/或工作经验。

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基因设计对重组蛋白表达的影响研究进展  

2016-02-01 10:55:21|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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: 利用异源表达系统生产重组蛋白已成为现代基因工程和生物工程研究热点和重点。但是研究者发现 并非所有的基因都能在异源宿主中高效表达,除了宿主、分泌途径、启动子等因素外,基因自身的序列也蕴含 了多种影响蛋白表达的因素,如密码子偏爱性,密码子对偏爱性,GC 含量,mRNA 二级结构,mRNA 稳定性 等。从基因设计的角度对影响蛋白表达的因素和方法进行了综述,尤其是对密码子优化和密码子对优化,详细 讨论了与传统基因优化理念截然不同的密码子协调化及密码子对协调化等最新进展。 关键词: 重组表达,基因设计,基因优化,密码子优化,密码子协调化,密码子对偏爱性 随着现代基因工程和生物工程理论和技术 的高速发展,无论是基础研究领域,还是生物 医药、农业、环保和食品等应用领域,利用异 源表达系统生产更高水平的目的重组蛋白都已 成为研究热点和重点。相对于原始基因在自身 宿主的表达,利用异源宿主表达重组蛋白具有 许多优点:首先,异源表达可能显著提高目的 蛋白的表达量;其次,异源表达中通常所选的 宿主具有相对透彻的研究背景,以及成熟的发 酵和分离纯化工艺,有利于提高生产效率、节 约成本;另外,异源表达中通常所选的宿主具 有生物安全性,在食品和医药方面,有利于避 免使用病原宿主而引发的潜在风险。1977 年,Genentech 公司的 Itakura [3]首次 完成基因的异源表达,将化学合成的人体蛋白生 长抑素基因以和 β-半乳糖苷酶基因融合的形式 在原核生物大肠杆菌 E. coli 中表达,并得到具有 功能活性的生长抑素。随着生物技术不断发展, 绝大多数的基因都能通过 PCR (Polymerase chain reaction) RT-PCR (Reverse transcription - Polymerase chain reaction) 等核酸扩增技术得 到,但是基因合成并不能被完全替代。人们把 PCR 扩增技术获得的完整基因克隆到表达载体 并转化到表达宿主后发现,克隆的基因经常不 能表达出重组蛋白,或仅仅表达出很低水平的 重组蛋白。研究人员通过各种手段一定程度地 缓解了这一问题,如提高宿主的分泌能力,使 用蛋白酶缺陷的宿主,提高基因的拷贝数,采 用强的启动子,融合表达,共表达分子伴侣等。 但是这些手段都忽略一个潜在但又非常重要的 问题,采用 PCR 扩增的编码蛋白基因在不同的 生物体内对应的 DNA 序列可能差异巨大。而这 些编码重组蛋白的核酸序列在其他生物体内表 达时,可能在转录、翻译等不同表达水平受到 各种因素的限制。因此,从不同角度对基因序 列进行优化或者重新根据蛋白序列进行基因设 计以提高蛋白重组表达的效率逐渐成为现代生物技术的研究热点之一。但目前基因设计和优化理论尚不完善,各种优化效果参差不齐,本文根据现有报道,系统综述了基因设计对重组蛋白表达影响的研究进展。 1 密码子优化 1.1 密码子影响蛋白表达机制不同物种的基因在密码子使用上存在着明 显的偏好性,甚至同物种内不同功能的基因其密码子使用频率也存在较大的差异,密码子偏 爱性对重组蛋白的异源表达具有深刻复杂的影响。在原核生物内,密码子使用频率已经被鉴 定为影响翻译的基因序列元件中重要的要素。密码子偏爱性在真核生物内同样是影响蛋白表 达水平的关键因素之一。目前,密码子偏爱性影响蛋白表达的主要机制已基本确定,生物体偏爱的密码子与体内对应的 tRNA 的丰度基本呈正相关,而 tRNA 的丰度决定在蛋白翻译延伸的过程中可用的氨基酸数量,从而影响了蛋白合成的效率。 1.2 密码子优化方法一方面异源表达系统具有自己的独特优 势,另一方面,由于不同生物的密码子偏爱性 存在差异,异源表达可能原始编码重组蛋白 基因从偏爱的密码子变成影响翻译的稀有密码 子。如何降低这一风险已成为异源表达系统的 重要步骤之一。 1.2.1 改造宿主 既然已知 tRNA 的缺乏可能导致对应的稀 有密码子在蛋白表达过程中使翻译速率降低甚 至终止,从而使蛋白水平显著降低,研究者为 了避免蛋白表达在翻译环节受到限制,应用了一种在宿主体内 (通常是细菌) 通过质粒补充 稀有密码子对应的 tRNA 的策略进行蛋白表达 的优化。这种方法在 E. coli 中应用非常成功 (例如 pRARE2),许多外源蛋白在 E. coli 中表达 量都显著提高。同时,在异源宿主中共表达特 殊的 tRNA 能在一定程度上修饰宿主的密码子偏 爱性效应并提高目的蛋白的表达量的现象,也间 接证明密码子偏爱性是通过控制可用的 tRNA 度影响蛋白的翻译过程。该方法已被广泛用作密 码子优化提高蛋白表达的策略之一。 1.2.2 稀有密码子替换 为了使外源基因在异源表达系统内有效表达,通过优化基因的密码子是十分有效的方法。 拥有所用宿主的稀有密码子越多的基因,越难在该宿主中表达出理想水平的重组蛋白,另外,如果稀有密码子出现在靠近蛋白的N-端部分, 或者以成串形式出现,则蛋白的翻译速率将进一步降低。密码子优化策略有几种,一种是选 用高频使用的密码子替代基因中存在的已选宿主的稀有密码子。可以通过定点突变的方法 逐步把原始基因改成预期的基因序列,能有效地降低成本。另外,这种方法的优点还包括不 需要对基因转录后的 mRNA 序列作出较大改动,假设原始基因的 mRNA 在进化过程中已经 具有比较合理的结构,那么这种方法能降低由 mRNA大幅度改变带来的不良影响。另一种 方法是在排除原始基因中的稀有密码子的基础 上进行重新合成,同时使密码子组成频率更接 近宿主。这种方法除了能对密码子进行修饰,还能根据研究者需要对基因序列进行其他方面的优化,包括限制性酶切位点改造、mRNA 定性优化等。 1.2.3 异源表达宿主的选择或同源表达 密码子的偏爱性与物种的亲缘关系有一定 的相关性,亲缘关系近的物种具有相对类似的 密码子偏爱性,为了降低密码子偏爱性对蛋白 表达影响的风险,较为简单的方法是在与基因 宿主有类似密码子偏爱性的异源表达宿主中表 达这一基因。利用同源表达 (Homologous expression) 技术发掘生物体自身的蛋白,尤其是酶资源, 受到越来越多的关注。同源表达技术可以用来表 达在其他异源表达系统中难以表达的蛋白,显著提高该蛋白的产量。Mayfield [12]在黄孢原 毛平革菌 Phanerochaete chrysosporium中成功表达了启动子改造后的自身蛋白锰过氧化氢酶基因。Jia 等在洋葱伯克霍尔德氏菌 Burkholderia cepacia 通过同源表达的方式过量表达了该菌株 自身的脂肪酶基因。同源表达与异源表达相比, 具有以下几方面的优点:1) 基因来源于自身, 表达菌株并不是严格意义上的转基因,在应用 领域 (尤其是食品) 更容易推广;2) 表达的蛋 白与宿主有更好的相容性,更有可能获得较高 的表达水平;3) 需要较少的基因修饰,如密码 子和密码子环境方面的修饰等。 1.3 密码子协调化随着对蛋白表达研究的不断深入,研究人员 发现即使宿主中高表达的基因中也存在一定的 稀有密码子。这引发了人们对密码子和蛋白表达 关系的新思考。由于核糖体对mRNA不同区域的翻译速率存在差异,并且蛋白质在核糖体能够 进行翻译时折叠,Thanaraj 等提出假设,翻译动力学可能影响新生肽链的折叠过程。他们进一步研究发现,高级结构或结构域之间的连接区域和蛋白域边界 (Protein domain boundary) 通常由RNA上翻译缓慢的区域编码 ( 1),同时组成 这部分区域的氨基酸也大多是能够通过与核糖 体的新生肽链通道发生粘连作用而减缓翻译速率的。因此,蛋白合成与蛋白的体内折叠并不是独立的两个过程,而是有着非常密切的相关性。另外,Komar 等通过体外翻译实验证明同义密码子之间的更换并不是严格的沉默突变,它能够影响蛋白质翻译延伸的速率,从而导致蛋白质折叠和功能发生变化。这表明基因核苷酸序列也一定程度上决定了重组蛋白的结构和功能。上述研究表明,密码子的优化必须与蛋白的高级结构联系起来,如果通过一味地替换稀有密码子来提高重组蛋白的表达可能会起到适得其反的结果。目前仍有很多蛋白不能通过密码子优化来实现高效表达也可能是欠缺这方面的考虑。

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