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人脐带细胞移植在神经系统疾病中的进展  

2016-02-14 11:36:22|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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要:人脐带组织富含间充质干细胞(MSCs),与其他来源的 MSCs 相比,具有来源丰富、容易提取、倍增时 间短、免疫原性低、移植后长期存活、不涉及伦理问题等多种优点,近年来对其研究越来越多。在适宜的环境 下,人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)可以分化为神经样细胞,移植于多种神经系统疾病动物模型后均可促进其 神经功能恢复,现就此方面的最新研究及应用进展予以综述。 关键词:人;脐带;间充质干细胞;移植;神经系统疾病 1. 引言 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) 一类具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细 胞,主要来源于骨髓、脂肪、脐带、脐血等,其中人 脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)分离成功率高、体外能 够大量扩增,越来越受到关注。很多中枢神经系统疾病表现为认知与运动功能渐进性恶化最终导致长期劳 动力丧失,为长期困扰医学界的难题。自 2003 Mitchell 等首次从脐带中成功分离出基质细胞并证 实其能向神经样细胞分化后,hUC-MSCs 移植在神经 系统疾病中的应用逐渐成为医学界研究的焦点。 2. hUC-MSCs 的来源及分离方法 2.1. hUC-MSCs 的来源 脐带为孕期胎儿与母亲之间的索状连接组织,外被羊膜,内由两条脐动脉与一条脐静脉构成,血管周 围被粘蛋白样组织即 Whartons 胶所包裹。脐带胶、 脐静脉血管内皮下及脐血管周围均富含 MSCs 2.2. hUC-MSCs 的分离培养 目前,hUC-MSCs 的分离培养尚未有标准方法。 常用方法有组织块贴壁法、酶消化法[2-4]以及两种方 法的结合。在无菌条件下,将手术台上采集的脐带 浸入含青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 ug/ml) PBS 缓冲液中,4℃保存,48 h 内处理。剔除血管、洗净 残血,于平皿中,用解剖刀将脐带分割成 1.5 cm 长的 小段,然后用剪刀剪碎成为 1~2 mm3的组织块,先后 经胶原酶Ⅳ(1 g/L)和胰酶(2.5 g/L)消化处理,细胞筛过 滤、离心、PBS 洗涤。将洗涤后的细胞接种于 90 mm 细胞培养皿上,加入 10 ml 培养液(DMEM/F12 + 10% 胎牛血清),置于 37℃、体积分数 5% CO2、饱和湿度 的细胞培养箱中培养,每 3~4 天半量换液,去掉未贴 壁细胞,直到细胞汇合度达 70%左右进行传代。传代 消化时,用 0.05%胰酶/EDTA 处理,收集细胞,离心 后以 1 × 104 /cm2的密度进行传代。传代培养过程中, 3 天全量换液,直至贴壁细胞达到90%汇合度。 3. hUC-MSCs 的生物学特性 根据国际细胞治疗协会制定的最低标准,MSCs 需具备以下条件:1) MSCs 在标准培养条件下呈贴壁 生长;2) MSCs 表达 CD105CD73 CD90,不表 CD45CD34CD14 CD11bCD19 CD79a HLA-DR 表面分子;3) MSCs 在体外至少能向成骨 细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。hUC-MCSs 是介于 胚胎干细胞与成体干细胞之间的一类多潜能干细胞, 高表达整合素及粘附分子 CD29CD44CD90CD95 以及常用的 MSCs 标志物 CD73CD105hUMSCs 还表达具有抑制免疫作用的 HLA-ABC HLA-G,以 及胚胎干细胞标志物 Tra-1-60Tra-1-81SSEA-1 (stage-specific embryonic antigen-1)SSEA-4Oct-4 碱性磷酸酶ALPMSCs骨架标志物平滑肌肌动蛋白 及波型蛋白。hUC-MCSs 不表达造血细胞标志物 CD34CD45CD14HLA-DR CD133 及内皮细 胞标志物 CD31vWF,也不表达或低表达移植免疫 排斥相关标志物 CD80CD86CD40hUC-MCSs 在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制状态,并抑制 T 胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,因此 异基因移植不会发生免疫排斥反应。 4. hUC-MSCs 向神经细胞的分化潜能 hUC-MSCs 在特定培养条件下可被诱导分化为神 经样细胞。多种诱导方案均可成功地将 hUC-MSCs 导分化为神经元及胶质细胞。Mitchell 等首先将脐带 胶基质细胞以碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)预处理过夜,再通过 2%二甲 基亚砜、200 ?M 丁基羟基茴香醚与 2%胎牛血清进行 诱导,5 h 后再经 25 mM 氯化钾、2 mM 丙戊酸、10 ?M 毛喉萜、1 μM 的氢化可的松及 5 ?g/ml 胰岛素进行诱 导,结果发现大部分细胞高水平表达神经元标志物 β-III 型微管蛋白和神经微丝。Ma 等将从脐带胶分离 出的 MSCs 先以 bFGF 预处理 24 h 后,然后再以丹参 β-巯基乙醇进行诱导,最后以 4%多聚甲醛固定处 理,经以上不同方法诱导处理1~5h后,细胞形态发 生明显变化,细胞萎缩、变小并形成突起,细胞逐渐 变成球形、星状或长条形;并表达巢蛋白、β-III 型微 管蛋白、神经微丝和胶质纤维酸性蛋白。Fu等通过 神经元条件培养基(neuronal conditioned medium, NCM) hUC-MSCs 进行诱导,第 3 天时可见细胞发生形态 学改变并表达神经元抗核抗体和神经微丝。Kadam [8]同样以 NCM 进行诱导培养后的细胞可使其表达神 经元特异性核蛋白 NeuN 及微管相关蛋白 Map2 hUC-MSCs 除能分化为神经元及胶质细胞以外, 还可向特定的神经元细胞分化。Fu等通过神经元条 件培养基、音猬蛋白和成纤维细胞生长因子-8,成功 地将 hUC-MSCs 诱导分化为表达酪氨酸羟化酶并分 泌多巴胺的多巴胺能神经元。Weiss等将hUC-MSCs 移植治疗帕金森病大鼠模型时发现,hUC-MSCs 除能 分化为酪氨酸羟化酶阳性的多巴胺能神经元,尚可表 达酪氨酸羟化酶阳性的胆碱能神经元。 5. hUC-MSCs 的治疗流程 1) 脐带采集: 签署知情同意书,取健康足月新生儿脐带约 10 cm 2) hUC-MSCs 的分离培养、纯化; 3) hUC-MSCs 扩增及鉴定: 根据 hUC-MSCs 的免疫表型,运用流式细胞术对分离、扩增细胞进行鉴定; 4) hUC-MSCs 移植治疗神经系统疾病: hUC-MSCs 可于体外诱导分化为神经干细胞或直 接移植治疗神经系统疾病动物模型或患者,通过减少 凋亡、抑制炎症、血管重建、细胞替代等作用发挥形 态与功能修复。 6. hUC-MSCs 移植在神经系统疾病中 的应用 人们对 hUC-MSCs 的认识较其他来源的 MSCs 对较晚,hUC-MSCs 移植在神经系统疾病中的应用目 前主要处于不同疾病动物模型的实验研究阶段。 6.1. 帕金森氏病 帕金森氏病是以纹状体多巴胺功能渐进性丧失 为特征的一种神经退行性疾病,目前尚无根治性治疗 措施。然而,hUC-MSCs 移植疗法为其带来了新希望。 Fu[9]hUC-MSCs移植到6-羟基多巴胺诱发的帕金 森病大鼠模型的纹状体内,发现表达人特异性核抗原 的酪氨酸羟化酶阳性细胞可在移植部位至少存活 4 月,并能向移植部位的头、尾两侧迁移约 1.4 mm,苯 丙胺诱发的大鼠转圈行为也得到了显著改善。Weiss 等发现,细胞移植后帕金森病大鼠的黑质和腹侧被 盖区内酪氨酸阳性细胞数目与大鼠的行为学改善呈 正相关,并推测移植细胞产生的胶质细胞源性神经营 养因子 GDNF 和纤维母细胞生长因子 FGF 对多巴胺 能神经元的营养作用可能是其促进神经功能恢复的 主要机制。 邱云等采用脐带 MSCs 移植治疗了8例帕金森 病患者,植入1月后发现,患者的震颤、强直有了明 显改善,但是运动迟缓、姿势不稳等临床症状无明显 改善,8 例患者均未出现移植物抗宿主病。结果提示 脐带间充质干细胞移植可以一定程度地改善帕金森 病患者的临床症状,提高患者生活质量。 6.2. 脊髓损伤 脊髓损伤是基于轴索变性、神经元与胶质细胞丢 失与周围病变部位脱髓鞘的一种疾病,最终将导致白 质纤维束永久性中断造成瘫痪。作为治疗脊髓损伤的 理想供体细胞应具有易于获取、倍增时间短、能够在 脊髓环境中长期存活、易于转染并长期表达外源性基 因等优点,hUC-MSCs 因具有上述优点,可作为治疗 脊髓损伤理想的细胞来源。Yang 等将 hUC-MSCs 移植到完全性横贯性脊髓损伤大鼠模型的损伤部位 后,大鼠的运动功能得到显著改善,病变周围皮质脊 髓束再生轴突和神经微丝的数目显著增加。Wang hUC-MSCs 移植到脊髓半切小鼠模型中,结果发现 小鼠的行为学随移植后时间的迁移而得到逐渐改善。

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