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喹赛多药理与毒理活性成分筛选研究  

2016-04-15 10:22:56|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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专业: 兽医药理学与毒理学 2013届硕士研究生:孙启亮 导师:袁宗辉教授 (国家兽药残留基准实验室(HZAU)/农业部食品安全评价重点开放实验室,华中农 业大学中国武汉430070) 摘要喹赛多作为一种新型的饲料添加剂具有良好的促生长作用,与喹嗯啉类其它药 物相比,喹赛多毒性作用很低。喹赛多在体内可被代谢成多种化合物,其中主要代 谢物有cylcy4cy6cyl2。迄今为止,仍然不明确喹赛多与代谢物的活性大小。所以有必要对喹赛多及其代谢物的活性大小进行比较,进而筛选出活性化合物,这对理解喹赛多的药理毒理研究作用机理具有重要的意义。 药物活性化合物筛选指标的选择成为实验的关键,通过文献调研并结合本实验室对喹赛多的实际研究进展情况,最终确定以EGFmRNA的表达作为喹赛多药理活性成分筛选的指标:以化合物与细胞孵育后对细胞活力的影响作为喹赛多毒理活性成分的指标。 1喹赛多的药理活性成分筛选 采用RT-qPCR技术,首先测定不同浓度的喹赛多与细胞孵育不同时间后EGF 的表达,以筛选出喹赛多与细胞作用后EGFmRNA上调表达的最佳浓度与时间点。 结果显示,29M喹赛多与细胞孵育1hEGF mRNA的表达量与空白组相比上调2 倍。喹赛多代谢物与细胞孵育后EGFmRNA上调倍数不如喹赛多显著,在所有代谢 物中cyl2EGF的上调作用最明显,达到了1.3倍,cy6其次,cyl最低。所以得 出喹赛多及其代谢物药理活性大小顺序为:喹赛多、cyl2cy6cy4cyl。加入P13K Akt抑制剂后,EGF mRNA表达量有所下调,这说明EGF mRNA的表达受 P13K.Akt调控。与P13K相比,AktEGFmRNA表达的影响更显著。21.tM喹赛多 可上调FOX01p53的表达,但上调倍数不明显。当Akt受抑制后,FOX01的表 达显著上调,同时p53表达显著下调;P13K受抑制后FOX01p53表达变化均 没有抑制Akt后的变化显著,这提示喹赛多激活的是Akt而不是P13K。当加入ROS 清除剂NAC后,喹赛多并不能使FOX01p53的表达发生显著变化,这提示喹赛 华中农业大学2013届硕士研究生学位论文 多可能通过代谢产生ROS从而激活Akt,喹赛多及其代谢物与细胞孵育后对Akt 酸化水平测定结果显示,喹赛多与其代谢物相比可明显促进p-Akt的表达。构效关系分析显示,喹赛多N.O基团是喹赛多的活性基团,N.0基团的代谢决 定着喹赛多的活性。N.O基团的代谢促进细胞ROS的产生,29M喹赛多与细胞孵育后,ROS15min左右即开始释放增加,在60min左右释放量达到最高。对细胞周 期相关蛋白cyclin DI进行荧光定量测定显示,喹赛多在2h左右即可引起cyclin D1 表达上调,在8h左右上调倍数达到最大,westem blot检测结果显示cyclin D18h 12h表达量明显升高。由以上结果我们推测,喹赛多可代谢产生ROS激活Akt,上调EGF的表达,促进细胞分裂周期相关蛋白的表达,从而促进细胞增殖,达到促生长效果。 2喹赛多毒理活性成分筛选 MTT实验与LDH释放检测实验结果显示,1009M喹赛多及其代谢物均可产生 较明显的细胞毒性,喹赛多的细胞毒性明显高于代谢物,以细胞毒性大小为指标确 定喹赛多及其代谢物毒性大小顺序为:喹赛多、cyl2cy4cy6cyl,这提示喹赛 多经代谢后毒性降低。荧光定量结果显示,EGFFOX01p53的表达呈现很明显 的量效关系,EGFFOX01的表达随着喹赛多浓度的增加而下降;p53的表达随着 喹赛多浓度的增加而上升。当Akt被抑制后,p53的表达显著下调,FOX01表达与 空白组相比无明显变化;P13K被抑制后,p53FOX01的变化没有Akt抑制后 的变化显著。这提示毒理浓度下喹赛多使Akt而不是P13K被过度激活,western blot 检测结果显示,喹赛多与Akt抑制剂共同孵育后,细胞p-Akt水平较高。 毒理浓度下细胞ROS释放测定结果显示,喹赛多与其代谢物相比能明显促进细 ROS产生,209M喹赛多即可显著促进ROS释放,且量效关系明显。时效关系测定显示,ROS释放量随着孵育时间的延长而升高,在90minROS释放量达到最 高,1009M喹赛多与其代谢物相比可明显促进细胞凋亡。 综上所述,本研究选用了合适的指标,分析了筛选指标的时效量效关系,比较 了喹赛多及其代谢物的活性大小,最终确定N.0基团是喹赛多的活性基团,喹赛多的药理毒理研究活性高于代谢物,喹赛多代谢产生ROS剂量大小决定喹赛多活性,低 剂量喹赛多浓度下,喹赛多代谢产生少量ROSAkt被轻微激活,细胞氧化磷酸化作用加快,细胞分裂加快,喹赛多表现出促生长效应;高剂量喹赛多浓度下,喹赛 喹赛多药理与毒理活性成分筛选研究 多代谢产生大量ROSAkt被过度激活,过度激活的Akt一方面使细胞线粒体负荷加重促使细胞产生更多ROS,另一方面ROS激活p53通路,促使细胞凋亡。由此可以确定喹赛多药理与毒理活性是使细胞释放不同剂量的ROS从而使细胞呈现出不同的反应。

 

 

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