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一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统  

2016-08-18 11:21:36|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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ABSTRACT

本发明属生物技术领域,涉及一种蛋白表达纯化系统,尤其是一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统。本发明的蛋白表达纯化系统,是将目的蛋白的两端,在N端连接一个新型荧光蛋白sGFP标签,在C端连接上一个组氨酸His短肽,并加有多核苷酸酶切位点,蛋白全长融合表达。同时可以根据需要在目的蛋白与标签之间加入蛋白酶切位点。该系统的目的蛋白表达效率能够得到改进,提高目的蛋白产率,全长蛋白在可见光下为绿色,可以实施监测蛋白表达效果、纯化过程;仅通过肉眼监视蛋白的表达效率、断裂程度及纯化流程。

DESCRIPTION

一种以重组蛋白为标签的表达纯化系统

技术领域

本发明属生物技术领域,涉及一种蛋白表达纯化系统,尤其是一种以重组蛋白为 标签的表达纯化系统,该表达纯化系统能够提高目的蛋白产率、实施监测蛋白表达效果、纯 化过程。

背景技术

已知蛋白质的生产、分离和纯化在生命科学研究和多肽类药物生产中具有重要的 地位。寻找使得蛋白质的产量提高、使得生产过程和纯化过程变的可视可控的良好方法,是 本领域研究人员的研究重点之一。目前广泛应用的是成熟的原核表达系统所用的标签有麦 芽糖结合蛋白标签(MBP),谷胱甘肽转移酶(GST)标签、组氨酸His标签等,这些标签在提 高蛋白的溶解度、帮助蛋白折叠方面显示了一定的作用。该表达纯化系统主要操作方法包 括:设计重组蛋白的融合片段,构建带有目的片段的载体,转入大肠杆菌表达,粗分离,层析 纯化和跑蛋白电泳验证。

但是,实践表明,目前的技术仍存在如下问题:对蛋白是否表达、表达量如何、是否 形成包含体沉淀、是否存在断表达等情况并不能有一个直观的了解;同时在蛋白纯化时,对 目的蛋白的走向一无所知,只能从峰值判断是否有蛋白流过;整个过程在暗箱中完成,需要 花费大量的财力和物力去检验等等。因此现有技术的蛋白纯化体系中使用的标签尚无法实 时指示目标蛋白在表达、纯化中的情况,蛋白纯化实验周期长,可控性弱。

发明内容

本发明的目的是为解决目前蛋白表达纯化中遇到的问题,提供一种以重组蛋白为 标签的表达纯化系统。该表达纯化系统能够提高蛋白表达效率、实时跟踪蛋白表达纯化情 况。

具体而言,本发明提供一种基于荧光蛋白的双标签“夹心法”蛋白表达纯化系统。

本发明采用新型荧光蛋白和His短肽为标签构建了一个双标签“夹心法”蛋白表 达系统,其特征是将目的蛋白的两端接上标签,在N端连接一个新型蛋白sGFP标签,在C 连接上一个组氨酸His短肽,并在荧光蛋白标签两端和目的蛋白片段两端加有多核苷酸酶 切位点,蛋白全长融合表达。本发明同时可以根据需要在目的蛋白与标签之间加入蛋白酶 切位点,His标签可以根据纯化需要缩短或延长。

本发明中,将目的蛋白接上不同标签后进行融合表达表达,用亲和层析进行纯化, 其中:荧光蛋白(superfold Green Fluorescence Protein, sGFP)为标签一,组氨酸His 头为标签二,构建成“夹心法”蛋白表达纯化系统。

本发明中,在目的蛋白N端接上荧光蛋白sGFP,在目的蛋白C端接上His6的短肽 和一个终止密码子,重组蛋白进行全长融合表达,并用Ni柱亲和层析纯化。

本发明中,在目的蛋白与sGFP间,在目的蛋白与His短肽间具有多核苷酸序列酶 切位点。

本发明中,在目的蛋白与sGFP间,在目的蛋白与Hi s短肽间具有可插入的蛋白酶 切位点。

本发明中,Hi s短肽接头具有不同的氨基酸个数。

本发明所述的载体表达的融合蛋白N端是一个新型荧光蛋白sGFP,该荧光蛋白自 身性质稳定,溶解度高,且能够帮助其C端的融合蛋白进行正确的折叠和表达,提高目的蛋 白的可溶性,适合作为蛋白融合标签。同时,在可见光下sGFP激发绿光,因此在蛋白表达和 纯化时能够对全过程可视化监控,仅通过肉眼监视蛋白的表达效率、断裂程度及纯化流程。

本发明中,提供了具有该双标签“夹心法”重组蛋白片段载体pT7Hi s,其中,重组蛋 白片段载体pT7His上有宿主体所识别的开放可读框orfAMP抗性标记进行筛选,限制性内 切酶位点 BamHINdel, Xhol, Ecol, SamI, Hindlll,以及一段 His 短肽基因。

本发明中,采用限制性内切酶技术,其能够在特定的核苷酸序列处切开位点,帮助 加入或去除所需要的片段。在荧光蛋白片段的两侧设计了多核苷酸酶切位点,能够帮助对 荧光蛋白的替换。本发明将sGFP荧光蛋白的DNA序列加入到所述载体的左端,使其能够优 先表达具有发光性能的荧光蛋白,使得整个表达纯化系统在第一时间达到可视化的效果。

本发明在目的片段两侧设计了多个核苷酸酶切位点,可以根据需要接入不同目的 蛋白的片段,且便于对目的蛋白片段的替换,在商业生产上能够进行大规模的批量操作。

本发明中,所述的His标签放在了重组蛋白全长片段的末端,即C端,使得只有当 该重组蛋白全长表达时,才能够具有His标签;而那些断表达的蛋白则不具有His标签,于 是可以通过镍柱亲和层析得到分离,并在流出液中根据颜色判断重组蛋白断表达情况。

本发明中,可以根据需要缩短或延长Hi s短肽的氨基酸个数,从而优化分离纯化 的效果。

本发明中,在将目的蛋白组装进载体的同时在其C端设计了蛋白酶切位点,在表 达纯化后将荧光蛋白标签切除,最终获得无大分子量标签的蛋白产品,能满足商业生产目 的的完整、没有任何接头的蛋白产品。

本发明在目的蛋白的基因片段N端接上新型荧光蛋白标签sGFP,在荧光蛋白标签与目的蛋白间加入蛋白酶切位点。sGFP亮度高,理化性质稳定,使得操作者能够通过颜色判断目的蛋白是否表达,其表达程度如何,在纯化过程中实时示综目的蛋白的走向,根据颜色收集有目的蛋白的洗脱液,不用经过电泳步骤即可进行后续实验,降低实验操作难度和实验经费。sGFP同时也能帮助其C端融合蛋白的折叠,对于低表达、易沉淀的蛋白能够提高其折叠效率和溶解性。蛋白酶切位点能够将大分子荧光蛋白标签去除,获得没有标签的完整目的蛋白,提高商业化的适用率。在目的蛋白片段C端接上His标签,用于镍柱的亲和层析系统,便于重组蛋白的纯化。当含有目的蛋白的样品上柱时,断表达的蛋白由于不具有His标签使得段表达蛋白不能上柱,在流出液中因有荧光蛋白标签故能指示指示蛋白的断裂表达情况。本发明在该载体系统中设计了多个核苷酸酶切位点,方便不同的用户选用熟悉或者偏好的酶进行重组加工,因此对大量不同目的蛋白的替换方便,适用于大规模研究和生产。

本发明的有益效果是:

1)荧光蛋白亮度高,而且稳定,有利于可视化。

2)荧光蛋白性质稳定,助折叠,能够提高目的蛋白增溶性。

3)双标签“夹心法”设计指示蛋白的断裂表达情况。

4)His接头长度根据纯化条件可任意调整。

5)多核苷酸酶切位点设计便于目的蛋白替换,操作便捷。

6)实时监控,节省时间和经费。

7)蛋白酶切位点有助于商业化生产目的蛋白。

8)蛋白表达纯化系统成熟,易于大规模推广。

9)可规模化、产业化,成批操作,带来可观经济效益。

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