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美迪西生物医药

 
 
 

日志

 
 

一种重组蛋白表达的快速检测方法  

2016-08-18 11:22:00|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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ABSTRACT

本发明涉及一种快速检测重组蛋白表达的方法。该方法利用免疫胶体金技术可以方便快捷地检测样本中是否存在重组蛋白。本发明可应用于生物医药相关科研中重组蛋白的表达实验,亦可应用于生物制药企业在重组蛋白药物的发酵生产过程中对重组蛋白表达水平的频繁检测与快速半定量评估。在这些应用中,本发明方法可部分取代常规的SDS凝胶电泳和免疫印记检测,显著简化了检测程序,缩短了检测时间并降低了检测成本。

DESCRIPTION

一种重组蛋白表达的快速检测方法

一技术领域

本发明涉及一种免疫胶体金偶联单克隆抗体的方法及应用,提供了一种应用于基因重组蛋白表达的快速检测方法,该方法利用针对重组表达蛋白中特定抗原表位(可以是标签或非标签成份)的特异抗体,可以简便/快速地判别生物标本中是否存在所表达的靶标蛋白,整个检测过程不超过30分钟。

二背景技术

基因的重组表达,已经成为生命科学技术中的一种常用手段,被应用于生命科学研究和生产的各个领域,如蛋白质的功能研究、生物医药研究、药物的生产等等。在基因的重组表达中为了方便外源基因表达的检测,大多数蛋白是以融合蛋白的形式进行表达,也就是在欲表达蛋白的氨基端或羧基端加入一些具有抗原表位性质的多肽序列,即表达标签,通过使用标签特异性抗体对表达样品进行检测,即可确定外源基因是否表达。常用的表达标签有:GST标签、His标签、c-myc标签、V5标签、HA标签、Trx标签、GFP标签及FLAG标签等等。这些常用的标签中有些还可以用来对表达蛋白进行纯化如GST标签和His标签就可以分别用谷胱甘肽和镍偶联的凝胶对表达蛋白进行亲和纯化。

在基因重组表达的研究和生产中,检测目的基因是否在宿主(细菌、真菌、细胞、 组织、器官)中表达是至关重要的。常用的检测方法有:对于表达量较高的原核表达系统来说,可以使用常规的SDS-PAGE进行检测,与未诱导或无插入片段的菌相比较,有明显的新的条带出现,即初步认为有目的基因的表达。对于表达量较低的原核表达载体和真核表达系统,SDS-PAGE染色后很难见到明显的表达条带,因此需要对样品通过灵敏度更高的免疫印迹(Western Blot)方法进行检测,以确定目的基因是否表达。

免疫胶体金技术自上个世纪70年代发明以来,已经广泛应用于生物医学领域。与传统的免疫临床诊断试剂相比,免疫胶体金试剂具有简便、快速、不依赖任何仪器的特点。免疫胶体金试剂的原理是通过将纳米金颗粒标记在特定的抗原和抗体上,当被标记的抗体或抗原与固相化的相应的抗原或抗体发生反应后,造成被标记的抗体或抗原在局部区域的聚集,从而产生肉眼可见的红色条带。与传统的SDS-PAGEWfestern Blot相比较,免疫胶体金技术具有简便、快速、不依赖任何仪器等特点:简便,样品处理方案简便,不需要电泳等过程;快速,Western Blot需要2天时间才能检测完成,SDS-PAGE也需要4——5小时,而本发明采用的免疫胶体金技术全过程不超过30分钟;不依赖任何仪器,SDS-PAGE需要电泳仪及相应的缓冲体系,Western Blot则需要的仪器试剂更多,免疫胶体金技术则不需要任何仪器,仅需要的简单缓冲体系即可。因此,本发明非常适合重组融合蛋白的快速检测,为科研研究、蛋白表达生产等节省了大量时间。

三发明内容

本发明的目的是要提供一种利用特异性抗体和胶体金技术,简便快速地检测基因重组蛋白表达的方法以及由此方法所产生的用于实现这一目的的相关试剂。基因的重组表达可以是天然蛋白表达纯化,也可以是带有标签的融合蛋白。当使用针对重组表达蛋白自身成份的特异性抗体时,本发明所用的方法与根据这些方法制备的试剂可以且只可以用于该种重组蛋白表达的检测。当使用针对重组融合表达蛋白中标签成份的特异性抗体时,本发明所用的方法与根据这些方法制备的试剂可以作为一种普适性的检测产品,用于检测带有该标签的任意融合蛋白的表达。在本发明方法中所适用的重组融合蛋白标签包括但不限于1) 在原核系统和真核系统中表达的带有His标签的融合表达蛋白;2)在原核系统和真核系统中表达的带有GST标签的融合表达蛋白;3)在原核系统和真核系统中表达的带有TRX标签的融合表达蛋白;4)在原核系统和真核系统中表达的带有V5标签的融合表达蛋白;5)在原核系统和真核系统中表达的带有c-myc标签的融合表达蛋白;6)在原核系统和真核系统中表达的带有HA标签的融合表达蛋白,7)在原核系统和真核系统中表达的带有GFP标签的融合表达蛋白8)在原核系统和真核系统中表达的带有FLAG标签的融合表达蛋白。本发明提供了实现上述目标的具体方法,包括:1)特异性重组蛋白抗体(针对重组蛋白中的标签或非标签成份)的选择及纯化;幻纳米金颗粒的制备方法;3)以纳米金颗粒标记抗体的方法;4)免疫胶体金快速检测试纸条的制备及组装方法力)使用免疫胶体金快速检测试纸条检测重组蛋白的方法;6)发明相关参数的检测方法

本发明所涉及的旨在简化重组标签融合蛋白表达检测步骤,缩短测时间,提高检测效率的方法,主要包括以下步骤:1)特异性重组蛋白抗体(针对重组蛋白中的标签或非标签成份)的选择与纯化,根据欲检测的重组蛋白的不同选用特异性识别所需检测的重组蛋白的抗体,该抗体可以是多克隆抗体,也可以是单克隆抗体。所选择的抗体需进行纯化, 纯化的方法可以选择目前使用的常规的抗体纯化方法,包括但不限于:辛酸-硫酸铵沉淀法、Protein AftOtein G亲和纯化法,以及抗原亲和纯化法等。2~)纳米金标记的抗体的制备,通过还原法制备一定直径的纳米金胶体溶液。本发明中所用的胶体金颗粒的直径为20nm,在现有的方法的基础上稍加改动可以制备直径范围在10-200nm之间的胶体金颗粒。然后用此胶体金溶液对纯化后的抗体进行标记,标记后的抗体经过纯化后用于免疫胶体金试纸条的制备。幻免疫胶体金快速检测试纸条的制备及组装方法。4)使用免疫胶体金快速检测试纸条检测重组蛋白的方法。

重组蛋白的表达是当前生物与医药科研相关领域广泛应用的实验技术。本发明利用免疫胶体金技术对包括但不限于原核和真核生物中表达的重组蛋白进行简便快速地检测,部分取代常规的SDS凝胶电泳和免疫印记检测,显著地提高了工作效率。在生物制药领域,在重组蛋白药物的发酵生产过程中需频繁检测重组蛋白的表达水平以相应地调节技术参数、确定发酵终点。本发明方法可以半定量方式对重组蛋白的表达水平进行快速评估,简化了检测程序,缩短了检测时间并降低了检测成本。

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