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纤维素结合域在棒状杆菌分泌表达系统中的应用  

2016-08-23 15:46:13|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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ABSTRACT:本发明属于蛋白表达纯化技术领域,具体是利用里氏木霉的纤维素结合域作为亲和标签,在棒状杆菌表达系统中进行分泌表达和纯化重组蛋白的方法。所述方法包括以下步骤:1)优化并合成编码里氏木霉糖苷水解酶I的纤维素结合域(CBD)的密码子序列;2)将步骤1合成的序列作为蛋白标签序列克隆至棒状杆菌分泌表达载体;3)将目的蛋白序列插入到步骤2获得的标签载体;4)将步骤3获得的重组载体转化至棒状杆菌中进行蛋白的分泌表达;5)CBD为亲和标签,利用纤维素柱纯化该重组菌分泌的重组蛋白。该方法不需菌体破碎,直接利用低成本的纤维素柱填料对诱导后的培养基进行蛋白纯化,从而降低蛋白的生产成本。

DESCRIPTION:纤维素结合域在棒状杆菌分泌表达系统中的应用

技术领域:本发明属于蛋白表达纯化技术领域,具体为利用纤维素结合域作为亲和标签,快速纯化棒状杆菌分泌表达的重组蛋白的方法。本发明涉及以CBD为亲和标签的棒状杆菌分泌表达载体的构建,以及利用纤维素柱纯化棒状杆菌所分泌的重组蛋白

背景技术:棒状杆菌是非病原性的革兰氏阳性菌,常被用于生产各种商品化的氨基酸和维生素。经过多年突变育种,原生质体和表达载体的改良,有望用于大规模的蛋白生产。2006,日本的Date等人利用谷氨酸棒状杆菌在培养基中分泌表达出具有活性的人类表皮生长因子,说明该系统具有大规模生产活性蛋白的能力。以棒状杆菌作为表达宿主有着极其明显的优势:1)遗传背景清楚,拥有高效的分泌信号肽及分子伴侣系统,所分泌的重组蛋白大多具有天然构象和生物活性;2)有两种分泌蛋白的途径:除常规的分泌途径,还可通过双精氨酸易位(Twin-arginine translocation, Tat)途径进行分泌,使所表达的蛋白直接分泌到培养基中,简化纯化步骤,降低生产成本ω ;3)属于革兰氏阳性菌,不产生脂多糖等内毒素,安全性好;4)分泌的蛋白酶极少,几乎不会对所表达的蛋白造成影响,即产物稳定[5];

5)作为表达宿主时间久,人们积累了极其丰富的发酵经验,严格好氧,生长迅速,培养条件简单,使用安全,无致病性,所以谷氨酸棒状杆菌是一种非常优良的工程菌株。

CBD(Cellulose-binding domain,CBD)是碳水化合物水解酶-纤维素酶的一个

结合纤维素的蛋白域,可提高细菌或真菌的纤维素酶活。该蛋白域有若干个含芳香族氨基酸残基的疏水表面,可亲和吸附到纤维素表面的疏水区。利用亲和标签纯化重组蛋白是生物工程中很常用的技术方法,常用的标签有多聚组氨酸,谷胱甘肽巯基转移酶,麦芽糖结合蛋白,链亲和素,几丁质结合域或者是它们的集合体等。能够与纤维素发生可逆吸附的CBD也是其中之一,它较为独立的空间结构对蛋白生物性能的干扰影响较小,而且纤维素作为吸附原料可以大幅降低分离成本。近年的一些研究已经成功应用CBD为纯化标签进行蛋白纯化。

在谷氨酸棒状杆菌的表达系统中,直接被分泌到胞外的目的蛋白可通过离心,透析,浓缩或亲和层析等方法获得。这些方法所使用的缓冲液及亲和树脂的高制造成本会加大蛋白纯化的代价,而在大规模的生产应用中,成本往往是必须考虑的重要因素。本研究应用CBD标签优化谷氨酸棒状杆菌表达系统的纯化工艺,试图降低该系统的蛋白纯化成本。

发明内容:本发明为一种分泌表达重组蛋白的纯化方法,具体是以CBD为棒状杆菌分泌表达系统的纯化标签,利用微晶纤维素作为柱层析填料对棒状杆菌分泌的重组蛋白进行纯化的方法,旨在优化蛋白表达的纯化工艺,降低成本。涉及含亲和标签CBD的棒状杆菌分泌表达载体的构建和用纤维素填料对分泌的重组蛋白进行纯化。

本发明提供下述:

1、利用里氏木霉的纤维素结合域作为亲和标签,在棒状杆菌的表达系统中进行分泌表达和纯化重组蛋白的方法。所述方法包括以下步骤:

I)优化并合成编码里氏木霉糖苷水解酶I的纤维素结合域(CBD)DNA序列;

2)将步骤I合成的序列作为蛋白标签序列克隆至棒状杆菌分泌表达载体;

3)将目的蛋白序列插入至步骤2获得的标签载体;

4)将步骤3获得的重组载体转化至棒状杆菌中进行蛋白的分泌表达;

5)CBD为亲和标签,利用纤维素柱纯化该重组菌分泌的重组蛋白。

 

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