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上海美迪西生物医药有限公司成立于2004年,位于上海张江高科技园区和上海川沙经济园区,是一家综合性的生物医药研发服务公司。目前公司拥有30000 平方米的研发实验室和国内一流的仪器设备。公司科研中坚力量由几位经验丰富的华裔博士和在美国制药领域工作多年的企业管理人士组成。公司现有员工800余人,约50%拥有博士学位或硕士学位,超过10%的员工拥有国外教育背景和/或工作经验。

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硒代蛋氨酸对EV71在体内外增值的影响  

2016-08-05 16:47:08|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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EV71 感染主要引起手足口病(Handfoot andmouth diseaseHFMD),人类是EV71病毒的唯一自然宿主,而患者以婴幼儿为主,大多数症状轻微,临床上表现为发热和手、足、口腔部位出现皮疹、溃疡等,严重的临床症状表现为无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、心肌炎和肺水肿等多种与神经系统相关的疾病。成人感染EV71后不会发病,但能传播EV71病毒。目前还没有特殊的预防措施可以有效预防EV71的传播,而我国手足口病的爆发案例呈逐年上升的趋势。

硒是人体必需的微量元素,在生物体内主要以硒代蛋氨酸形式参与各种生理环节、发挥不同生物功能,主要是起到抗氧化,清除机体和细胞产生的氧化自由基作用,从而直接和间接地与多种重大疾病相关联。很多学者的研究都证实了,硒能加强机体的免疫能力,使用硒代蛋氨酸培养基,主要参与T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和中性粒细胞分化能力和功能的调节。硒与很多病毒的毒力存在一定的相关性,如禽流感病毒、艾博拉病毒、肝炎病毒、猪细小病毒、HIV、流感病毒等。硒会影响入侵病毒的复制能力、突变率及毒力效应。流行病学调查和病理学研究发现,病毒感染缺硒的患者后,其疾病发展程度较为严重。这与缺硒机体的免疫能力低下、病毒毒力增强及病毒突变率增加等相关。

VERO细胞复苏后,正常生长培养基中生长并传二代。到下一次传代时,将VERO细胞接种到六孔板,加入1μmol/mL的硒代蛋氨酸使得硒代蛋氨酸在培养基中浓度分别为0μmol/L2μmol/L3μmol/L,每个浓度重复8个孔。细胞培养24h后,接种肠道病毒EV71。接种肠道病毒的细胞继续在细胞培养箱中培养,并于接种后的第4d和第7d分别取300μL的培养上清液利用QIA?GEN公司的Viral RNA mini Kit提取病毒核酸后通过荧光定量RT-PCR(中大达安基因:肠道病毒71型核酸检测试剂盒)进行病毒RNA拷贝数的鉴定。如果采集的上清液不能及时进行处理,则需将样品保存于-20℃。

把购买的雌性ICR小鼠分为4组,每组6只。第一组超纯水饲养,第二组含5mg/L硒代蛋氨酸超纯水饲养,第三组含1mg/L亚硒酸钠超纯水饲养,第四组含5mg/L亚硒酸钠超纯水饲养,每组小鼠的饲料都为常规饲料(硒含量为38.5ng/g)ICR小鼠饲养8周后,通过尾部采血法采集50μL小鼠静脉血,5%EDTA抗凝。使用谷胱甘肽过氧化物酶测试盒(南京建成)测定小鼠血液中的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性,每星期测定一次,直至各组的小鼠谷胱甘肽过氧化物酶酶活性存在统计学差异。然后把雄性放进第1~4组雌性小鼠的笼内,每组1只,让1~4组小鼠繁殖交配。

1234组内取刚出生3~5d的幼鼠各6只,腹腔注射感染EV71,每只感染量为50μ(该毒液滴度为7.5×108pfu/mL)。分别于病毒感染后的5d7d,采集小鼠后腿肌肉组织和血液。采集小鼠肌肉组织时,要对采集的肌肉进行称重,每支管里装25mg肌肉,并冻存于-80℃的冰箱中直到使用。通过提取相同重量肌肉组织总RNAQIAGEN公司的Rneasy Mini Kit)进行荧光定量RT-PCR(使用中大达安的肠道病毒71型核酸检测试剂盒),将得到的CT值通过方差分析组别间的差异性。

硒代蛋氨酸对EV71 在体外细胞增殖的影响通过荧光定量PCR测定了3组别EV71增值4d7d时的核酸载量,结果发现只有培养4d时,3组别间EV71的核酸载量差异有统计学意义。在含0μmol/L硒代蛋氨酸培养基中的EV71RNA扩增CT值显著小于其余2EV71核酸扩增CT值(P <0.05),而含2μmol/L 硒代蛋氨酸培养基中EV71 核酸扩增CT值显著小于3μmol/L硒代蛋氨酸培养基中EV71核酸扩增CT值(P <0.05)。而培养7d时,经统计学方差分析,3个组别中EV71 核酸扩增的CT值差异无统计学意义(P >0.05)。

本实验也证实了补充硒代蛋氨酸培养基使小鼠体内GSH-PX的酶活得到提高。从而增强了小鼠体内的氧化应激能力,对抑制病毒的复制起促进作用。硒代蛋氨酸对免疫细胞的增值化有一定的促进作用。但有学者研究了硒代蛋氨酸这种硒源对兔体外淋巴细胞的影响,发现亚硒酸钠、硒化卡拉胶只有在较窄的范围内促进了淋巴细胞转化,而硒代蛋氨酸则在1×10-1~1×10-5mol/L的浓度范围内对细胞均有促刺激作用,浓度越大刺激越明显。

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