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一对特异识别绵羊基因的多肽及其编码基因和应用  

2016-08-08 16:25:56|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西是一家药物研发外包服务公司(CRO),在上海建立了一家集化合物合成、化合物活性筛选、结构生物学、药效学评价、药代动力学评价、毒理学评价、制剂研究和新药注册为一体的符合国际标准的综合技术服务平台,并得到了国际药品管理部门的认可。2008年与美国MPI Research公司合作建立美迪西普亚,专注于临床前的药代动力学和安全评价研究。美迪西普亚的动物实验设施获得AAALAC(国际动物评估与认证协会)认证和中国食品药品监督管理局GLP证书,并已达到美国食品药品管理局GLP标准。美迪西以高效、高性价比的一站式专业服务帮助客户更快地达到目标。

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ABSTRACT

本发明公开了一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽,其由多肽甲和多肽乙组成;所述多肽甲由16TAL核酸识别单元组成,每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸;所述多肽乙由16TAL核酸识别单元组成,每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸。本发明可实现在细胞或个体水平上对绵羊MMP2基因进行敲除或修饰,以解析绵羊MMP2基因的功能、构建绵羊MMP2基因突变库或获得相关疾病模型,为绵羊育种及医药研发服务

DESCRIPTION

—对特异识别绵羊圖P2基因的多肽及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域,涉及一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽及其编码基因和应用。

背景技术

MMPs是一个重要的蛋白酶家族,含有锌离子和活性位点保守的蛋氨酸残基(Bodeet al., 1993 Stocker et al., 1995)。一系列类似的蛋白酶被发现(人类中发现23种,小鼠有24)MMPs曾经被认为主要在细胞外基质结构成分的降解中发挥作用。然而,最近研究发现,MMPs参与众多生理和病理学过程(Page-McCaw et al.2007),他们会影响细胞移行,产生有生物学功能的底物切割片段,通过作用于细胞外基质和细胞间黏结,活化、失活信号分子或改变信号分子的活性,来调节组织重构。在几乎所有人类癌症和过敏性炎症反应中,MMPs 的表达均上调(Egeblad and Werb,2002 Becky Kelly et al.,2000)。多项研究表明,MMPs参与肺脏疾病的病理过程(Zheng et al., 2000 Kumagai et al., 1999 Holla et al.,2000 Cataldo et al.2000),也促进内皮基质膜附近的炎症细胞的聚集(Haas and Madri, 1999 Madri et al.,1996)

MMP-2MMP家族的重要成员之一,是基底膜的主要结构成分。此酶也影响生长因子结合蛋白和生长因子受体的活性。MMP-2能够切割IGF结合蛋白并释放IGFs (Sternlichtand Werb1999),刺激细胞增殖,抑制凋亡。MMP-2敲除小鼠表型明显:剧烈的哮喘症状,由过敏源引起的窒息(Corry et al.,2002);体型变小(Itoh et al.1997);血管新生缺陷(Kato et al.2001),等等。MMP-2在炎症和免疫方面发挥着至关重要的作用。它影响被招募免疫细胞的清除,削弱炎症反应(Corry et al.2002)MMP-2参与建立趋化梯度,在防止窒息致死中发挥作用。

基因表达谱芯片研究结果显示,敖汉细毛羊被毛丰富的体侧部皮肤MMP2基因的表达量相对于腹股沟部(无被毛)下调13.52倍,这一结果通过定量PCR得到了验证(Zhaoet al.2012)

综上所述,MMP2基因可作为绵羊抗病育种及羊毛细度育种的一个重要候选基因。在细胞或个体水平上对绵羊MMP2基因进行敲除或修饰,可解析绵羊MMP2基因的功能,为绵羊育种及医药研发服务

转录激活子样效应因子核酸酶(transcription       activator-like effectornucleases,TALENs)技术是一个高效的基因打靶新工具。转录因子激活效应物家族中有一种蛋白(TALEs)能够识 别、结合DNATALEDNA序列特异性结合主要是由TAL结构内34个恒定氨基酸序列介导。将TALEsFokI核酸内切酶的切割域相连接,形成TALENs,从而可以实现对基因组DNA序列的精确修饰。TALENs是一种异源二聚体分子(两单位的TALEDNA结合结构域融合到一单位的催化性结构域),能够切割两个相隔较近的序列,从而使得特异性增强。发明内容     本发明的目的是提供一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽及其编码基因和应用。本发明利用这对多肽构建获得的一对重组的转录激活子样效应因子(TALE)能够特异性地识别绵羊MMP2基因。本发明还利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs),能够对绵羊MMP2基因进行准确、高效地靶向修饰。

具体地,本发明的目的是这样实现的:

一对特异识别绵羊MMP2基因的多肽(命名为特异多肽对),由多肽甲和多肽乙组成;所述多肽甲由16TAL核酸识别单元组成,每个TAL核酸识别单元中具有一个双连氨基酸;所述多肽乙由16TAL核酸识别单元组成,每个TAL核酸识别单元中具有一个双连

氨基酸;

所述多肽甲中的16个双连氨基酸依次如下:序列表的序列2N末端第12-13位氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251位氨基酸残基、第284-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基、第488-489位氨基酸残基和第522-523位氨基酸残基;

所述多肽乙中的16个双连氨基酸依次如下:序列表的序列4N末端第12-13位氨基酸残基、第46-47位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第114-115位氨基酸残基、第148-149位氨基酸残基、第182-183位氨基酸残基、第216-217位氨基酸残基、第250-251位氨基酸残基、第2 84-285位氨基酸残基、第318-319位氨基酸残基、第352-353位氨基酸残基、第386-387位氨基酸残基、第420-421位氨基酸残基、第454-455位氨基酸残基、第488-489位氨基酸残基和第522-523位氨基酸残基。

所述多肽甲的氨基酸序列具体可如序列表中的序列2所示。

所述多肽乙的氨基酸序列具体可如序列表中的序列4所示。

本发明还保护一对DNA分子(命名为特异DNA分子对),由编码所述多肽甲的DNA分子甲和编码所述多肽乙的DNA分子乙组成。

所述DNA分子甲中,编码所述多肽甲的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下:序列表的序列45’末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸和第1564-1569位核苷酸;

所述DNA分子乙中,编码所述多肽乙的16个双连氨基酸的核苷酸依次如下:序列表的序列45’末端第34-39位核苷酸、第136-141位核苷酸、第238-243位核苷酸、第340-345位核苷酸、第442-447位核苷酸、第544-549位核苷酸、第646-651位核苷酸、第748-753位核苷酸、第850-855位核苷酸、第952-957位核苷酸、第1054-1059位核苷酸、第1156-1161位核苷酸、第1258-1263位核苷酸、第1360-1365位核苷酸、第1462-1467位核苷酸和第1564-1569位核苷酸。

所述DNA分子甲的核苷酸序列具体可如序列表中的序列I所示。

所述DNA分子乙的核苷酸序列具体可如序列表中的序列3所示。

本发明还保护所述特异多肽对在特异识别和靶向修饰绵羊MMP2基因中的应用。所述绵羊 MMP2 基因,其 NCBI Gene ID 261244993

本发明还保护所述特异多肽对在构建绵羊MMP2基因突变库中的应用。所述绵羊MMP2 基因,其 NCBI Gene ID 261244993

与现有技术相比,本发明提供了特异识别绵羊MMP2基因的多肽对,并提供了该多肽对的编码基因。本发明可实现在细胞或个体水平上对绵羊MMP2基因进行敲除或修饰,以解析绵羊MMP2基因的功能、构建绵羊MMP2基因突变库或获得相关疾病模型,为绵羊育种及医药研发服务

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