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一种药物筛选细胞模型及其构建方法与应用  

2016-09-23 09:51:55|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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ABSTRACT:本发明公开了一种药物筛选细胞模型及其构建方法与应用,其目的是提供一种药物作用机制明确,药物筛选直接、快速、简便,适合于大规模药物筛选的药物筛选细胞模型。该模型采用STAT作为药物筛选的分子靶点并包括荧光酶报告基因。本发明提供了一种构建该药物筛选细胞模型的方法,是将串连的STATDNA结合序列亚克隆至荧光酶报告系统载体,然后分别将重组载体转入体外培养的细胞系中使之稳定表达,得到药物筛选细胞模型。该细胞模型可以用于药物有效成分的大规模高通量筛选。

技术领域:本发明涉及基因工程领域中一种药物筛选细胞模型及其构建方法与应用,特别涉及一种应用JAK/STAT信号通路的药物高通量筛选细胞模型及其构建方法与应用。

背景技术:药物筛选模型是寻找和发现新药物的重要条件之一。分子与细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少,药物作用机制明确,可实现大规模筛选等特点,已经成为目前药物筛选的主要方法。

在过去的十年中,有关细胞因子的作用机制已被广泛地研究。其中最重要的发现是许多种细胞因子必须通过一种信号转导和活化因子蛋白质分子发挥作用。STAT家族由7个成员组成,它们是STAT1STAT2STAT3STAT4STAT5aSTAT5bSTAT6。在已发现的7STAT蛋白分子中,STAT1STAT2主要在干扰素的信号传导及基因调控中起重要作用。STAT3不仅在和gp130有关细胞因子的信号传导和基因调控中、在Src激酶家族及其它因子引起的肿瘤形成、发展中有相当重要的作用,而且在器官发育、组织分化中也有重要作用。STAT4STAT6在免疫系统的发生、分化及执行其特定功能中有多方面的作用,并包括TB淋巴细胞的分化、生长和激活。STAT5包括两个基因,分别为STAT5aSTAT5bSTAT5最初在羊类的催乳素的研究中发现,稍后发现STAT5在生长激素,血红细胞生成素(EPO),以及IL-2的信号传导中起重大作用。

现已明确,在JAK/STAT细胞信号通路中,当细胞因子结合其特定的细胞受体后,细胞质内的一类蛋白激酶JAK立即被磷酸化从而被激活,此类激酶进一步磷酸化细胞受体胞内区的特定氨基酸。STAT蛋白含有一特殊的SH2功能域,其作用是结合磷酸化后的细胞受体胞内区,然后STAT蛋白和JAK激酶相接触。STATJAK和细胞受体等蛋白分子形成由细胞因子引发的蛋白质聚合体。在相互作用中,STAT蛋白被JAK激酶进一步磷酸化,从而被激活。根据细胞因子的种类不同,激活后的STAT蛋白形成同源(STAT1-STAT1)或者异源双聚体(STAT1-STAT3)从细胞质转移到细胞核内,结合特定的STAT基因调控DNA序列,从而调节有关基因的表达,进而实现细胞因子引发的各种效应,如细胞生长,分裂,分化死亡等,并实现特定的细胞功能。

随着STAT分子家族在先天性和获得性免疫系统,造血系统,肿瘤发生中的关系的深入研究,以STAT为分子靶点的药物开发有望取得更广泛的应用。

本发明提供的药物筛选细胞模型,是克隆了STAT家族中2-20个串连的STATDNA结合序列及荧光酶报告基因的体外培养细胞;所述STAT选自STAT1STAT2STAT3STAT4STAT5aSTAT5bSTAT6中的一种或几种。

其中,STATDNA结合序列是药物筛选的分子靶点,串连的STATDNA结合序列可以是STAT家族7个成员中不同成员的串连,也可以是相同成员的重复串连,还可以是混合串连。所述体外培养细胞优选的是人T细胞淋巴瘤(Jurkat)、人肝母细胞瘤(HepG2),人胚肾细胞(293T细胞),当然,体外培养的哺乳类细胞都可以。

本发明的第二个目的是提供一种构建药物筛选细胞模型的方法。

本发明提供的构建药物筛选细胞模型的方法,是将2-20个串连的STATDNA结合序列和荧光酶报告基因转入体外培养的受体细胞中,得到药物筛选细胞模型;所述STAT选自STAT1STAT2STAT3STAT4STAT5aSTAT5bSTAT6中的一种或几种。所述串连的STATDNA结合序列的合成方法为人工合成较短的序列后用连接酶连接而成。

所述荧光酶报告基因来自于Promega公司商业化pGL2pGL3系列载体质粒。

本发明巧妙地以STAT响应来构建药物筛选细胞模型,以STAT作为分子靶点进行药物开发,避免了针对细胞整体水平的筛选盲目性,药物作用机制明确。具有直接,快速,简便的优点,非常适合于大规模的药物筛选。

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