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一种体外PXR激活特性筛查的方法  

2016-10-14 10:57:19|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西在药物安全性评价方面有专业的团队和实战经验,可提供高质量的数据和快速的周转期以支持各项药物安全评价研究。毒理学研究可按照非GLP或者GLP标准执行。我们的研究平台已被评为上海研发公共服务平台。联系我们:marketing@medicilon.com.cn web:www.medicilon.com.cn

机体维持正常生理功能必须将一些外源性物质代谢转化为极性化合物排出体外, 这一清除与解毒的过程主要依赖于肝脏系统细胞色素P450 (CYP)基因表达调控来实现。同时治疗各类疾病的药物越来越多,联合用药已成为通常的治疗手段,而药物间相互作用引起的不良反应也随之增加,其中很大部分与药物相互作用有关。多数药物发生相互作用的机制与药物代谢相关,尤其是与细胞色素P450酶(cytochrome P450CYP450)有关的代谢。 细胞色素P450是由许多同工酶组成的超大家族,参与药物代谢的主要有CYP3A4CYP1A2 CYP2C9CYP2C19CYP2D6等,其中CYP3A4是具重要意义的一族,大约50%的药物经其代谢, 其与药物代谢最密切相关,因此有必要将药物安全性评价引入到药物研发的早期,通过相关筛选技术的建立发现可能存在的药物相互作用,提高创新药物的安全性。研究表明多种药物可通过核受体PXR(孕烷X受体,PregnaneXRectorPXR)从而诱导CYP3A基因的表达。P)(R蛋白全长434个氨基酸,其结构包括氨基端保守的DNA结合区和羧基端的配体结合区。药物能直接与核内的P)(R配体结合域结合,继而与另一核受体视黄醛X受体(RetinoidXreceptor,RXRNR2B1)形成异二聚体,该异二聚体与靶基因启动子上的外源性化学物反应元件结合,促进CYP3A的转录和酶蛋白的表达,同时加强其对底物的代谢能力。鉴于P)(R CYP3A酶的生成中发挥了重要的介导作用,P)(R受体的激活会引起CYP3A酶的合成加速, 不仅增加药物本身的代谢,而且会加速体内其他药物的代谢,诱发药物-药物相互作用。

报告基因法通过检测外源物对PXR的激活能力来预测其对CYP3A4的诱导效应,是目前常用的筛选药物相互作用的方法。比较了报告基因法与原代培养的人肝细胞模型在预测CYP3A4诱导剂时的相关性,结果表明两种方法具有很好的相关性。Noracharttiyapot W 等将报告基因载体单独稳定转染HepG2细胞,筛选得到了对利福平有明确诱导效应的功能性单克隆细胞株,但其每次检测荧光时均需要裂解细胞。

目前已鉴定出多种能与PXR/RXR 二聚体结合的直接重复序列DR-3DR-4DR-5 DR-8等和反向重复序列ER-6ER-8等应答元件。上述序列分布于多种与药代动力学相关的代谢酶基因启动子中,与cyp3a4相关的主要是位于近侧启动子区域的ER-6、位于转录起始位点上游7. 2?7. Skb处的远端外源物反应增强子模体(XREM)及位于转录起始位点上游8. Skb处的DR-3等。Fu-Jun LIU等研究发现,转录起始位点上游7. 2?7. Skb处的远端外源物反应增强子模体(XREM)中的DR-3元件对P)(R介导的利福平诱导至关重要,其缺失后利福平的诱导作用基本消失。

结论:P)(R被配基药物激活时,人的PXR/RXR二聚体可以结合到靶向CYP基因启动子(Promoter)内的反应元件上,从而调控CYP3A基因表达。P)(R基因缺失小鼠失去CYP3A的药物诱导性。相反,在转基因小鼠肝脏表达激活状态的hP)(R受体可导致CYP3A酶的持续性高表达。由于P)(R作为外源化合物诱导CYP3A表达的关键转录调控子的理论已被广泛接受,因此本发明建立了基于此通路高通量筛选的关键技术并在药物研发早期即对化合物库中的海量化合物进行P)(R激活特性筛查,可以间接反映其是否具有CYP3A的诱导特性,能激活P)(R受体的化合物可能导致不期望的药物相互作用或产生毒性的代谢产物,研发初始阶段即淘汰这些化合物可以减少新药上市后产生不良药物相互作用的风险,同时使研发费用大大降低。

本发明中,发明人设计了双远端增强子报告基因载体9号,从诱导实验结果看,利福平对9号的诱导倍数要高于只有一个远端增强子的1号载体,而且9号的荧光值也要远远高于1号,说明双远端增强子的存在,提高了报告基因载体的效能,这样的载体此前尚未见文献报道。

许多化合物包括处方药利福平、St.JohnsWort以及一些杀虫剂等都可以与P)(R受体结合。药物对代谢酶CYP450的诱导效应是导致临床药物间相互作用的主要原因。因此在药物研究和开发过程中,建立筛查CYP450药物诱导剂的方法,淘汰诱导CYP450表达的先导化合物,而多发展一些CYP450透明(CYP450-transparent即无CYP450诱导或抑制活性)的新药,对于降低新药研发成本及避免临床上的药物相互作用具有重要意义。

本发明利用分泌型Gaussia荧光素酶报告基因pGLuc-Basic系统,构建了包含 CYP3A4基因启动调控序列的报告基因载体,通过与人P)(R表达载体体外共转染HG2细胞, G418压力筛选下获得了稳定转染单克隆细胞株,由于报告基因的荧光素酶分泌到胞外,因此直接检测细胞上清即可,避免了裂解细胞。利福平药物诱导实验,鉴定到9+PXR-3号细胞株具有明确的诱导效果。发明人利用此细胞株进一步检测了7种已有药物对PXR 的激活能力,其中,硝苯地平为已知的P)(R激动剂,酮康唑为已知的P)(R拮抗剂,发明人的结果见,进一步表明本发明方法报告基因法准确、可靠。此筛选体系的建立,对于预测CYP3A酶诱导及药物相互作用的发生,为药物临床应用指导和新药开发提供有益信息具有重要意义。本研究符合建立早期、灵敏、快速、可靠的药物安全性评价的新模型,提高药物安全性评价的准确性,属于体外药物安全性评价替代模型,能够成为快速的药物安全性评价筛选工具并成为药物安全性评价关键技术中的组成部分。

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