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上海美迪西生物医药有限公司成立于2004年,位于上海张江高科技园区和上海川沙经济园区,是一家综合性的生物医药研发服务公司。目前公司拥有30000 平方米的研发实验室和国内一流的仪器设备。公司科研中坚力量由几位经验丰富的华裔博士和在美国制药领域工作多年的企业管理人士组成。公司现有员工800余人,约50%拥有博士学位或硕士学位,超过10%的员工拥有国外教育背景和/或工作经验。

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生物素化蛋白质的制备  

2016-10-28 11:07:02|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面有10余年经验积累,美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为你在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系,以提高您的目的蛋白表达水平。邮箱:marketing@medicilon.com.cn 网址:www.medicilon.com.cn

本发明涉及一种生物素化蛋白质的制备方法,包括以下步骤:(a)构建一种具有多功能的联合标签的蛋白表达载体,所述联合标签至少包括:便于重组蛋白纯化的标签,含有特异蛋白酶切位点的标签,以及生物素化标签;(b)把目的蛋白的编码序列克隆到步骤(a)所述的蛋白表达载体中,所述联合标签与目的蛋白进行融合表达,获得在体内或体外对融合蛋白中的生物素化标签进行生物素化的重组蛋白;以及(c)采用与联合标签相适应的特异性蛋白酶切除融合蛋白中的便于重组蛋白纯化的标签,并切断联合标签中的特异蛋白酶切位点,获得高纯度的生物素化蛋白质。本发明具有过程集成、工艺简单、生物素化效率高、蛋白结构和活性不受生物素化影响等优点。

技术领域:本发明属于生物技术领域,更具体地,本发明涉及生物素化重组蛋白的制备工 艺。

背景技术:生物素可特异性地与亲和素(Avidin)、链霉亲和素(Streptavidin)非常紧密地结 合,每个亲和素或链霉亲和素能结合4个分子的生物素,且亲和力极强,亲和素常数(K) 1015L/mol,比抗原与抗体间的亲和力(K = 10.5?llL/mol)至少高100倍,二者的 结合特异性高和稳定性好。利用此种生物素-亲合素系统具有特异性强的亲和作用,可 将蛋白质标记上生物素(即生物素化蛋白)后,可被亲和素/链霉亲和素特异性的结合, 从而实现识别检测、生物大分子捕获、蛋白相互作用检测等应用。生物素化蛋白已经广 泛应用于免疫学、细胞生物学和分子生物学的实验研究领域,例如在高通量蛋白质相互 作用筛选中,得到广泛运用的AlphaScreen技术(www.perkinelmer.com),就是利用微珠 表面的链霉亲和素把生物素化的蛋白固定作为供体,而受体微珠则利用微珠表面的蛋白 A(ProteinA)固定另一蛋白。在激光(波长为680nm)的照射下,供体微珠上的光敏剂将 周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧,单体氧扩散至受体微珠,与其上的化学发 光剂反应,激活了在受体微珠上的荧光基团,使之发出波长为520?620nm的荧光(单体 氧的半衰期为4μ Sec,在溶液中的扩散距离为200nm左右。如果生物分子不存在相互作 用,单体氧无法扩散到受体微珠,则不会有荧光信号产生)。

目前制备生物素化蛋白质的方法有:(1)将目的蛋白纯化后通过化学生物素标记法得到生物素化蛋白,通常利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物,然后与目的蛋白质进行化学反应。此种方法由于反应条件比较剧烈,化学方法生物素化过程中,一些相对敏感的蛋白容易失活;同时,由于活化的生物素不具有识别特定蛋白质的能力,因而化学方法生物素化是非特异的。(2)通过生物素化标签与目的蛋白融合表达,在体内或体外把生物素标签进行生物素化,从而实现重组蛋白的生物素化。如通过大肠杆菌生物素连接酶(BiotinLigase)活化生物素形成生物素酰-5'-腺苷酸,将 生物素特异地转移到生物素受体标签蛋白-AviTag的赖氨酸上,使蛋白生物素化;大肠杆菌生物素酰基载体蛋白(biotin carboxylcarrier protein, BCCP)是大肠杆菌CoA羧化酶的一个亚基,能够在生物素合酶的催化下,在其C端赖氨酸上连上一个生物素,使蛋白生物素化。这种特异性的定点修饰,对蛋白的活性影响小,产物专一,但是此种方法必 须把目的蛋白与生物素标签(如AviTag等)进行融合表达,然后进行纯化得到高纯度的重组蛋白,但是生物素受体标签蛋白-AviTag不能适用于蛋白纯化,而且也无法提高重组 蛋白的表达效率和可溶性,往往导致与AviTag融合蛋白不能可溶表达或难以纯化。

发明内容:本发明的目的在于提供一种生物素化蛋白质的制备方法,该方法操作简便、生物素化效率高、蛋白结构和活性不受生物素化影响。

本发明所述的一种生物素化蛋白质的制备方法,包括以下步骤:

(a)构建一种具有多功能的联合标签的蛋白表达载体,所述联合标签至少包括:便于重组蛋白纯化的标签,含有特异蛋白酶切位点的标签,以及生物素化标签;

(b)把目的蛋白的编码序列克隆到步骤(a)所述的蛋白表达载体中,所述联合标签与目的蛋白进行融合表达,获得可在体内或体外对融合蛋白中的生物素化标签进行生物素化的重组蛋白;

(c)采用与联合标签相适应的特异性蛋白酶切除融合蛋白中的便于重组蛋白纯化的标签,并切断联合标签中的特异蛋白酶切位点,获得生物素化蛋白质。

根据本发明所述的生物素化蛋白质的制备方法的进一步特征,所述便于重组蛋白纯化的标签至少包括:六组氨酸(6His)标签、谷胱甘肽转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、硫氧还蛋白(Trx)标签。

根据本发明所述的生物素化蛋白质的制备方法的进一步特征,所述含有特异蛋白酶切位点的标签至少包括:小泛素相关修饰物(Small ubiqitin-related ModiferSUMO)、烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco etch virus Protease)识别序列、肠激酶 (Enterokinase)识别序列、凝血酶(Thrombin)识别序列、Xa因子(FactorXa)识别序列。

根据本发明所述的生物素化蛋白质的制备方法的进一步特征,所述的生物素化标签至少包括:AviTag(GLNDIFGAQKIEWHE)及其衍生物、大肠杆菌生物素酰基载体蛋白(biotincarboxyl carrier proteinBCCP)及其衍生物、酵母受体肽(yeast acceptor peptide, yAP) (TTNWVAQAFKMTFDP)及其衍生物。

本发明还提供了一种蛋白表达载体,该载体含有具有多功能的联合标签,以及可调控的启动子、复制起始子、抗性筛选标记元件,所述联合标签至少包括:便于重组蛋白纯化的标签,含有特异蛋白酶切位点的标签,以及生物素化标签。

本发明还提供了一种试剂盒,包括:如前所述的蛋白表达载体、特异性的蛋白酶、能将生物素化标签进行生物素化的细胞或酶。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征,所述特异性的蛋白酶至少包括:小泛素相关修饰物蛋白酶、烟草蚀纹病毒蛋白酶、肠激酶、凝血酶、Xa因子。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征,所述能将生物素化标签进行生物素化的细胞至少包括:表达细菌生物素连接酶的细胞、表达细菌生物素合成酶的细胞、表达酵母生物素连接酶的细胞。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征,所述把生物素化标签进行生物素化的酶至少包括:细菌生物素连接酶、细菌生物素合成酶、酵母生物连接酶。

本发明的优点在于:(1)利用生物素标签,如AviTag,可在体内或体外被生物素连接酶高效和高特异性生物素化的特性,与目的蛋白进行融合表达,所获得的生物素化蛋白是在生物素化标签进行生物素化,而不是在目的蛋白上进行生物素化,因此对目的蛋白的活性和结构影响很小;(2)利用其它标签提供便捷高效的纯化方法,然后再利用蛋白酶切除其它标签,只保留生物素化标签和目的蛋白,从而获得生物素化蛋白。通过本发明所述制备方法获得的生物素化蛋白质能够最大程度保证生物素化的均一性和蛋白的活性,并且能够定向固定在亲和素包被的磁珠表面,可广泛用于免疫检测、复合物捕获、AlphaScreen等应用中。

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