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美迪西生物医药

 
 
 

日志

 
 

单克隆抗体双段和单段的制备方法  

2017-01-11 10:30:54|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西普亚提供的药物安全评价Package研究资料向CFDA、美国FDA、澳大利亚TGA申报InvestigationalNewDrug(简称IND)15次,用美迪西普亚提供的非临床安全评价单项研究资料向CFDA、美国FDA、澳大利亚TGA申报Investigational New Drug (简称IND) 60余次。邮箱:marketing@medicilon.com.cn 网址:www.medicilon.com.cn

本发明涉及生物技术工程。

1975konlerMilstein建立杂交瘤技术以来,单克隆抗体在医学基础研究与临床疾病诊治中得已广泛应用,特别是在肿瘤的体内诊断与治疗方面,单克隆抗体展示出十分诱人的应用前景。1987年美国FDA批准CD3单抗用于临床,1990年已达到1千万美元的年产值,在我国131I-HAb18肝癌单抗放免显像剂与治疗剂,已进入II期临床研究,肿瘤显像率达90.6%,治疗有效率为69%,在体内诊断方面,单克隆抗体双段[F(ab)2]和单段[Fab]片段抗体同完整鼠抗体IgG相比由于去除了FC段,具有分子量少,到达肿瘤部位迅速,血液本底和非瘤组织清除块等优点;在体内治疗方面F(ab)2片段抗体,降低了人抗鼠异种蛋白排斥反应,提高了重复给药几率。美国FDA已批准数十种F(ab)2Fab片段抗体的体内放免药物进入临床研究。

目前,国内外有关F(ab)2Fab片段抗体的制备方法较多,用分子筛、离子交换或Protein A等色谱纯化F(ab)2Fab,其方法陈旧工艺复杂,无法在中试中放大和大规模生产,纯度也无法达到理想的标准。1992年日本的KoichiMorimotoKuniyo Inouye报道了用TSKge1 Phenyl-5PW疏水色谱法纯化IgG1鼠单抗F(ab)2片段抗体,纯度达98%,但TSKge1 Phenyl-5PW纯化柱为分析型柱,不适宜中试放大研究。在F(ab)2Fab片段抗体的质量控制方面,国内外均未见报道。

本发明F(ab)2Fab片段抗体的制备方法,纯化手段采用Phenyl SepharoseHigh Performance疏水色谱,经二次纯化后F(ab)2Fab的纯度均可大于98%,回收率大于50%,整个过程无菌无热源控制,纯化后产品立即冻干,室温有效期二年,其纯度和活性未有改变。完全达到中国药品生物制品鉴定所有关人用鼠源性单抗质量控制标准,适宜做大规模生产。

本发明的技术方案:单克隆抗体腹水,用50%的饱和硫酸胺粗提二次,抗体蛋白沉淀物用0.1M柠檬酸缓冲液(PH3.5)充分溶解后,调正浓度为10-20mg/ml,再离心去除不溶物。F(ab)2制备用胃蛋白酶与IgG酶切比例为110037℃反应2-3h,用3MTris调正PH7左右,以终止反应;Fab用木瓜蛋白酶,酶与IgG的比例110037℃反应1-2h0.25(W/V)碘乙酰胺终止反应。HPLC疏水液相色谱法纯化F(ab)2Fab片段抗体,用Phenyl Sepharose High Performance疏水色谱柱(Pharmacia)分二次纯化:一次纯化A液为11.4M硫酸胺0.05M PH5.0醋酸钠缓冲液,B液为0.05M PH5.0醋酸钠缓冲液。二次纯化A液用0.71.0M硫酸胺0.05M PH5.0醋酸钠缓冲液,B液为0.05M PH5.0醋酸钠缓冲液,线性梯度洗脱时间30-40分钟。纯化后立即冻干,加10%低分子右旋糖酣做复性剂。

本发明的实施例:一、单克隆抗体的腹水处理分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞1×1061ml,接种清洁级BABL/c小鼠腹腔;8-12天后无菌收集腹水,离心3000g×20min,去除沉淀物;上清用0.8μ滤膜过滤后;用0.01M PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)等体积稀释;缓慢加入50%饱和硫酸胺(固体),静止2小时后,离心10000g×20min,沉淀用0.01M PH7.4PBS溶解后,再加50%饱和硫酸胺,静止2小时后,离心10000g×20min

二、F(ab)2Fab的制备1.胃蛋白酶酶切F(ab)2片段抗体饱和硫酸胺粗纯化后的抗体沉淀物,用100mM柠檬酸缓冲液(PH3.5)充分温匀溶解后,调节浓度为10-20mg/ml,离心10000g×10min,去除未溶解物。胃蛋白酶(pepsin)(Sigma公司lot No.P688 7,活性3200-4500单位)酶切比例pepsin(mg)IgG(腹水中蛋白含量mg)1100,放入37℃水浴箱中2小时,终止反应加10%体积的3M Tris,使之PH7左右。

2.木瓜蛋白酶酶切Fab片段抗体饱和硫酸氨粗纯化后的抗体沉淀物和木瓜蛋白酶,分别用0.05M Tris-HCL2mM EDTA1mM DTT缓冲液透析,酶与抗体加入比例为1100,混匀后37℃孵育1小时,0.25(W/V)碘乙酰胺终止反应。

3.疏水色谱纯化F(ab)2FabHPLC液相色谱系统(Water 650),蛋白检测用紫外分光280mm波长,PhenylSepharose High Performance疏水色谱柱(Pharmacia Bi otech)一次纯化A液:1.2M硫酸氨0.05M PH5.0醋酸钠缓冲液,B液:0.05M PH5.0醋酸钠缓冲液,用A液平衡4-5个柱体积,流速4ml/min。酶切后产物加60%饱和硫酸胺,离心10000g×20min,弃上清,沉淀物用A液溶解上柱,待穿过峰流出后,上线性梯度,硫酸氨浓度从1.2MOM,时间30分钟。F(ab)2出峰时间大约在20-30分钟之间,Fab出峰时间大约在15-25分钟之间。一次纯化后,F(ab)2Fab纯度大约在90%左右,F(ab)2回收率约为70%,Fab回收率约为50%。

要提高样品的纯度,需再进行二次纯化,二次纯化A液用0.8M硫酸氨醋酸钠缓冲液,B0.05M PH5.0醋酸钠缓冲液样品用A液溶解,用相同的方法上样,梯度洗脱,收集F(ab)2Fab洗脱峰。二次纯化后,F(ab)2Fab纯度均大于98%,回收率F(ab)2大于50%,Fab大于40%。

4.纯化后产品的冻干纯化后的片段抗体溶液,加60%饱和硫酸胺离心沉淀,在PH7.4 0.01M PBS溶液中透析除盐,调整蛋白浓度,加10%低分子右旋糖酣做复性剂,冷冻干燥,4℃或室温保存。

安全性评价:无菌性是对药物安全性的最基本的要求之一。各种热原质、内毒性、鼠源性病毒以及残留的酶,虽然在分子量大小及化学组成上差异较大,但绝大多数都是具有亲疏水极团的极性分子。我们在F(ab)2Fab片段的纯化方法上,采用高效疏水色谱,并采用二次纯化法,可有效地去除热原质、核酸、病毒等杂质。

无菌试验按中国药典1995版二部附录79页进行需气菌、厌气菌、霉菌、细菌培养,无任何细胞成长为合格。

细菌内毒素试验按中国药典二部附录77页,设2Eu内毒性工作标准品作阳性对照,并同时进行干扰试验。阳性对照阳性,干扰试验阳性,样品阴性为合格。

残留DNA含量测定:用DNA标记测定盒(Boehringer Manhaim),样品中DNA残余量应<100pg

产品纯度鉴定:采用SDS-PEAG聚苯烯酰胺凝胶电泳,F(ab)2电泳采用还原和非还原两种条件,还原条件下凝胶浓度为12.5%,非还原条件下凝胶浓度为7.5%,用中分子量标准蛋白(Promega)。在还原条件下,完整IgG重链约50KD、轻链约26KDa,酶切后F(ab)2重链约30KDa、轻链约26KDa Fab28KDa;在非还原条件下IgG的分子量约160KDaF(ab)296KDaFab50KDa,电泳结果用日本岛津CS-9000薄层扫描仪扫描,计算纯度百分比。

产品活性鉴定:生物学活性测定是保证生物制品药物产品有效性的重要手段,对于单克隆抗体药物尤为重要。肿瘤抗体活性鉴定,采用ABC免疫组化法或免疫荧光法,抗体做梯度稀释,设定阳性标准品和阴性对照,测定抗体免疫结合活性效价。

稳定性考察:药品的稳定性是保证药品有效性和药物安全性的重要指标,也是确定药品有效期限的主要依据。片段抗体比较完整抗体稳定性差,在一般的缓冲液中冰冻保存极易降解,影响纯度和活性。因此,片段抗体纯化后必须立即冻干,有效期可延续1-2年。

产品一致性的保证:单克隆抗体的大规模生产,杂交瘤细胞在传代培养过程中,要防止细胞变异,染色体丢失,抗体分泌产量降低等问题。杂交瘤细胞必经建立种子细胞库,生产细胞库,以保证每批量生产抗体的一致性。另外在培养基的组成成份、血清、添加剂及酶的来源与质量以及制备工艺上都应保证尽可能的规范化和一致性,严格条件控制和质量检定,以确保各批最终产品安全、有效、稳定、一致,达到中国药品生物制品鉴定所人用鼠源性单抗质量标准。

本发明的优点:1.F(ab)2Fab片段的纯化方法上,采用高压液相Phenyl Sepharose HighPerformance疏水色谱二次纯化法,纯度可大于98%,回收率大于50%,并可有效地去除热原质、核酸、病毒等杂质。

2.工艺简单,流程短,整个过程无菌无热原控制,纯化化产品立即冻干,室温有效期二年,其纯度和活性未有改变。完全达到中国药品生物制品鉴定所有关人用鼠源性单抗质量控制标准,适宜做大规模生产。

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