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重组仙台病毒载体的纯化方法  

2017-02-28 15:56:20|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西是一家药物研发外包服务公司(CRO),在上海建立了一家集化合物合成、化合物活性筛选、结构生物学、药效学评价、药代动力学评价、毒理学评价、制剂研究和新药注册为一体的符合国际标准的综合技术服务平台,并得到了国际药品管理部门的认可。2008年与美国MPI Research公司合作建立美迪西普亚,专注于临床前的药代动力学和安全评价研究。美迪西普亚的动物实验设施获得AAALAC(国际动物评估与认证协会)认证和中国食品药品监督管理局GLP证书,并已达到美国食品药品管理局GLP标准。美迪西以高效、高性价比的一站式专业服务帮助客户更快地达到目标。

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本发明提供了一种重组仙台病毒的纯化方法,其过程是将收集的病毒初始液与来源于动物的红细胞在低温下混合一定的时间,然后在低温条件下低速离心,收集沉淀;沉淀再用洗液洗涤,洗涤后的沉淀在37℃温浴一定的时间,然后在室温条件下低速离心,收集上清液即为病毒纯品。

本发明属生物医药技术领域,涉及重组病毒载体的纯化方法,更具体是应用于重组仙台病毒纯化。

基因治疗是当今最具发展前景和发展最快的前沿生物技术之一。研究结果表明很 多疾病都是由于直接或间接原因基因自身出现异常及功能障碍导致的。随着人类基因组的 解析,有关疾病与基因关系的信息越来越多。基因治疗就是把与疾病有关的基因制成药剂 导入患者体内,达到治疗疾病的目的。这是一种尖端信息快速转为实用化的最新医疗技术。 —般的基因治疗载体,进入到细胞核内作为DNA来表达目的基因所编码的蛋白。 在细胞核内有整合到靶细胞的染色体上,或者与染色体DNA发生基因重组的危险。有报告 表明,虽然发生频率极低,但逆转录病毒载体有诱发白血病的可能。另外,已知腺相关病毒 载体在被整合的染色体附近,可引起局部的不可逆性的染色体结构变化。因此,在使用这些 载体时必须慎重考虑利弊问题。仙台病毒载体是细胞质型RNA载体,对各种动物细胞有较 高的感染效率;它本身不进入细胞核内,在细胞质中进行基因表达,在理论上不存在改变细 胞核内染色体的危险性,与其他载体相比具有更高的安全性。从根本上解决以往载体存在 的生物安全隐患的不足之处。

临床前研究中,重组仙台病毒载体在重度下肢缺血基因治疗制剂、阿耳茨海默 病(早老性痴呆症)疫苗、艾滋病疫苗都表现出了极好的治疗效果。由于仙台病毒载体的 基因表达水平很高,可望获得以往载体所不能实现的更好的治疗效果。此外,该载体即使是 较少剂量也可发挥相应的治疗效果,相比其他载体需要几十分钟以上的细胞接触才能获得 较满意的基因导入效果,重组仙台病毒载体仅在几分钟之内便可完成,在临床上可以减轻

患者及医生的負担,是一种非常快捷实用的载体。因此仙台病毒载体有比较广阔的应用前旦豕。

重组病毒在对于所有应用之前,都要在宿主细胞中增殖之后从宿主细胞中进行纯 化这一过程。 一般的方法包括细胞培养、感染宿主细胞、收获裂解宿主细胞、浓縮粗制裂解 物、核酶消化处理、以及进一步层析纯化。大多数改良的方法都集中在选用不同性质的层析 介质和超速离心。本发明是利用了仙台病毒蛋白的特点创造性的提出了新的纯化途径,其 过程是将收集的病毒初始液与来源于动物的红细胞在低温下混合一定的时间,然后在低温 条件下低速离心,收集沉淀;沉淀再用洗液洗涤,洗涤后的沉淀在37t:温浴一定的时间,然 后在室温条件下低速离心,收集上清液即为病毒纯品。收集的病毒纯品也可以选用相应的 层析介质做进一步的精纯化。

为更好的说明本发明的内容,对仙台病毒的结构做简单的介绍。

仙台病毒(Sendaivirus,SeV)属于副粘病毒科副粘病毒亚科、呼吸道病毒属病毒,为单股负链RNA病毒。RNA分子量4.76X106D,病毒粒子多是呈圆形,直径130?250nm。病毒内部由直径约18nm的螺旋状对称结构的核蛋白组成,外包有脂蛋白囊膜,其上有放射状排列的纤突,纤突长8X15nm,宽2X4nm

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