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一种hiv药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒  

2017-02-07 10:21:42|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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本发明公开了一种HIV药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒。本发明构建了表达HIVGag基因和Pol基因的重组表达质粒、表达报告基因的重组慢病毒质粒和表达HIVRev基因的重组质粒。将上述3种质粒和表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒共转染哺乳动物细胞,成功获得了假型慢病毒。将假型慢病毒感染哺乳动物细胞,可得到基于报告基因的HIV药物筛选细胞模型。本发明提供的药物筛选细胞模型,使用单次感染的病毒,具有良好的安全性,并且报告基因使该细胞模型具备极高的敏感性。

本发明涉及一种HIV药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒。背景技术

人免疫缺陷病毒,又称艾滋病毒,由HIV感染而引起的疾病称为艾滋病,全称为获得性免疫缺陷综合征,该病患者的免疫功能部份或完全丧失,CD4+细胞数目减少,继而发生机会性感染、肿瘤等,临床表现多种多样。该病传播速度快、病死率高,目前无法治愈,引起了各国政府和社会的关注。HIV的流行呈世界性分布,非洲为HIV的发源地和重灾区,欧洲和美洲也为主要流行区,近年HIV在亚洲的流行呈高速增长的趋势。我国自1985年首次发现HIV感染者,至今已有60?80万人发生了感染,专家估计,如果不迅速采取有效的预防措施,按目前的年平均30Q/o的增长速度,到2010年,我国的HIV感染者将超过1000万。在非洲的有些国家,HIV的感染率达总人口30%以上。因此,预防和治疗艾滋病,已不仅仅是挽救个人生命的问题,而是关系到民族存亡的大事。

HIV在病毒分类学上属逆转录病毒科慢病毒属,目前已发现两种HIV,分别为HIV-lHIV-2。两者具有相似的病毒结构和传播途径。HIV-2主要分布于非洲西部,在欧洲和美洲的一些感染者中也被检测到,毒力和传播力都低于HIV-1,引起的艾滋病病程较慢且较缓和。HIV-1广泛分布于世界各地,是引起全世界AIDS流行的病原,目前HIV的研究也是以HIV-1为主进行的。

艾滋病病毒(HIV)颗粒呈球形,直径90nra?130nm。病毒的核心呈中空锥形,由两条相同的单链RNA链、逆转录酶和蛋白质组成。核心之外为病毒衣壳,呈20面体立体对称,含有核衣壳蛋白质。最外层为包膜,包膜上的糖蛋白有刺突状结构,是HIV与宿主细胞受体结合位点和主要的中和位点。HIVRNA中含有gagenv禾口pol基因以及6种调控基因。gag基因编码病毒的核心蛋白;pol基因编码病毒复制所需要的酶类(逆转录酶、整合酶和蛋白酶);env基因所编码的病毒包膜蛋白,是HIV免疫学诊断的主要检测抗原。HIV主要侵犯人体的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞,其感染过程包括病毒的吸附、侵入、逆转录、基因组的整合、表达及释放等过程。当感染发生时,病毒的外膜糖蛋白gpl20首先与细胞表面的CD4分子结合并与辅助受体CCR5CXCR4等结合,gpl20空间构象发生改变,暴露出跨膜蛋白gp41与细胞膜作用,导致病毒包膜与细胞膜融合,病毒核心进入细胞内,脱壳后病毒基因组在RT作用下以病毒RNA为模板合成cDNA,再以此cDNA为模板合成双链DNA,在病毒整合酶IN的作用下随机整合到细胞染色体上成为前病毒而长期存在并随细胞的分裂而传至子代细胞。该前病毒即为病毒复制时的转录模板,病毒进行复制时,早期转录的长链mA经剪接后表达病毒的调节蛋白,待调节蛋白的量到达一定阈值后,病毒进入晚期转录,产生的未拼接的mRNA部分用来指导合成病毒的结构蛋白,部分作为病毒的基因组,与结构蛋白进行装配成为病毒核心颗粒,由胞膜出芽时获得包膜及膜蛋白。

目前,国内HIV药物筛选主要采用具有感染性的HIV病毒感染人淋巴细胞系,这种细胞模型由于使用了野生型HIV病毒,对人具有感染性,必须严格限制在负压的P3实验室进行,此外该系统不含报告基因,结果检测程序复杂且灵敏的不高。发明内容

本发明的目的是提供一种HIV药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒。本发明提供了一种表达HIVGag基因(gag)Pol基因(pol)的重组表达质粒。

所述表达HIVGag基因和Pol基因的重组表达质粒具体可为如图1所示的pGag-Pol

本发明还提供了一种混合质粒,包括表达HIVGag基因和Pol基因的重组表达质粒和表达报告基因的重组慢病毒质粒。

所有常规报告基因均可使用,如荧光素酶基因(包括萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶),荧光蛋白基因(包括绿色荧光蛋白及其各种衍生物,红色荧光蛋白等),氯霉素乙酰转移酶基因(CAT),!3-半乳糖苷酶基因(e-Gal)或葡萄醛酸糖苷酶基因(GUS)

所述混合质粒还可包括表达HIVRev基因(rev)的重组表达质粒和表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白(VSV外膜糖蛋白)基因的重组表达质粒。

所述表达HIVGag基因和Pol基因的重组表达质粒具体可为图1所示的pGag-Pol;所述表达报告基因的重组慢病毒质粒具体可为图2所示的pLenti-Luc;

所述表达HIVRev基因的重组表达质粒具体可为如图3所示的pRev;所述可表达疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白基因的重组表达质粒具体可为pVSV-G

本发明还提供了一种假型慢病毒,是通过如下方法得到的:将所述混合质粒共转染哺乳动物细胞,得到假型慢病毒;所述哺乳动物细胞优选HEK293细胞、293T细胞、293FT细胞或Hela细胞。

含有所述假型慢病毒的细胞也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的HIV药物筛选细胞模型,是用所述假型慢病毒感染的哺乳动物细胞;所述哺乳动物细胞优选HEK293细胞、293T细胞、293FT细胞或Hela细胞。

所述假型慢病毒、所述细胞模型均可应用于HIV药物筛选。

通过用己知抗HIV药物对本发明提供的HIV药物筛选细胞模型进行测试,HIV药物处理组细胞中的荧光素酶活性低于对照组。

本发明构建了表达HIVGag基因和Pol基因的重组表达质粒、表达报告基因的重组慢病毒质粒和表达HIVRev基因的重组表达质粒。通过将上述3种质粒和pVSV-G质粒共转染哺乳动物细胞,成功获得了假型慢病毒。将该假型慢病毒感染哺乳动物细胞,即可得到基于报告基因的HIV药物筛选细胞模型。本发明提供的药物筛选模型,使用单次感染的病毒,具有良好的安全性,而报告基因使该药物筛选模型具备极高的敏感性。

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