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His 标签蛋白纯化全攻略  

2017-04-14 10:14:28|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面有10余年经验积累,美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为你在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系,以提高您的目的蛋白表达水平。Email:marketing@medicilon.com.cn Web:www.medicilon.com

作为重组蛋白构建过程中最常用的标签,相信奋战在实验室中的小伙伴对His标签并不陌生。His标签可通过Ni2+柱进行简单有效的纯化,不过纯化容易想要纯化好却并不那么容易。爱纯派助力 His 标签纯化,马上为大家送上 His 标签纯化全攻略。

His 标签蛋白的纯化原理

组氨酸(His)的残基上带有1个咪唑基团,可以和Ni2+Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上,这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上,因此带有组氨酸标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上,而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱,从而得到较高纯度的 His 标签蛋白。

His 标签蛋白纯化说起来简单做起来难。小编也常常收到小伙伴们类似于“His 标签重组蛋白 Ni2+柱纯化后纯度不够”、“His 标签蛋白挂不到 Ni2+柱上”等等之类的抱怨。其实呢,不怕做不到,就怕没想到。His 标签蛋白纯化是有很大的优化空间哦~

His 标签纯化优化策略

His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和金属离子之间配位结合作用力的强弱,而这种作用力主要和一下因素相关:

1)标签长度及暴露程度:最常用的His标签时6个重复的组氨酸,但在实际操作过程中,根据实际情况可控制组氨酸的数目从四到十个不等。较短的标签与金属离子的结合更弱,较长的标签与金属离子的结合更强;而标签的暴露程度也很容易理解,金属离子只能和蛋白表面的 His 结合,所以 His 标签暴露程度越高,结合能力越强。

2)金属离子半径:除最常用的Ni2+以外,但Cu2+Zn2+Co2+等金属离子都可用于His标签蛋白的纯化,不同金属离子区别在于离子半径不同,离子半径越小,与 His的结合能力也就越强。几种常用金属离子和 His 的结合能力为:Cu2+Zn2+Ni2+Co2+

3)缓冲液条件:His标签蛋白在中性或弱碱性pH值(pH78)环境下显现出比在酸性条件下与金属离子更强的结合能力。在磷酸缓冲液中His标签蛋白表现出比在Tris-HCl缓冲液中与金属离子更强的结合能力。咪唑由于可以和His标签蛋白竞争与金属离子的结合,所以缓冲液中咪唑浓度的升高,会导致His标签蛋白与金属离子结合能力的减弱。一些可以鳌合Ni离子的试剂如EDTA或柠檬酸等等蛋白与金属离子的结合能力有较大影响,应避免使用。

4)结合时间:一定范围内His标签蛋白与金属离子的接触时间延长结合能力自然就会有一定增强。知道了与结合能力强弱有关的主要因素,大家知道在 His 标签纯化中遇到问题时应该怎么解决了吧?

His 标签纯化常见问题 1:蛋白不挂柱

蛋白不挂柱说白了就是蛋白和柱子的结合能力不足导致的。根据上面说的几点影响结合能力的因素,我们可以按照以下思路来排查下原因吧。

1His标签还在吗?大肠杆菌表达外源蛋白过程中,有时候会出现序列丢失的现象,若是标签丢失,蛋白自然无法挂柱了。那么检测方法也很简单,找个 His抗体通过 Western-Blot 检测下立马知道结果了。

2)标签表达以后暴露在蛋白表面吗?在蛋白中加入适量的尿素或者盐酸胍等变性剂看下蛋白能不能挂柱,若此时可以挂柱,说明蛋白表达过程中His标签可能暴露不充分。这个时候,可以尝试在变性剂存在条件下纯化,若不能接受变性条件纯化,只能尝试上游修改了,要么增加 His 标签长度,增加暴露在外面的His个数,要么修改 His 添加的位置。

3) 选择了什么金属离子?如果选择的是 Ni2+或者 Co2+,换成作用力更强的 Cu2+或者 Zn2+可能可以解决问题。

4)缓冲液条件对吗?如果发现缓冲液中竟然出现了EDTA等鳌合剂,必须要去掉哦。此外适当提高缓冲液pH、降低缓冲液中的咪唑浓度、调整缓冲液中的盐浓度或者更换成磷酸缓冲液都可能提高 His 标签蛋白的挂柱能力。

5) 接触时间够吗?适当尝试延长接触时间,可能提高挂柱能力。

His 标签纯化常见问题 2:蛋白挂柱后洗脱不下来

蛋白无法柱是结合能力不足导致的,那么挂柱洗不下来自然是因为洗脱条件太温和不至于破坏较强的作用力造成的了。那么参照常见问题1的解决方法,咱们一起来看看遇到这样的问题应该怎样解决吧。

1) 洗脱强度不够?增加洗脱的咪唑浓度或者降低 pH 进行更加剧烈的洗脱。

2) 蛋白和柱子有其他非特异的吸附?洗脱缓冲液中加入去垢剂(0.2% TritionX-100)进行洗脱。

3)蛋白是不是沉淀在柱子内部了呢?尝试降低上样量或通过咪唑现行梯度洗脱来降低蛋白浓度尽量避免蛋白沉淀。如果以上办法都尝试了还是得不到理想的结果,那只能从适当减弱上样阶段 His 标签蛋白和金属离子的相互作用入手想办法了。

1)改变缓冲液条件:降低缓冲液的pH、提高咪唑浓度、调整盐浓度或者换成Tris-HCl缓冲液有可能都能帮到忙。当然,EDTA这些鳌合剂因为直接和金属离子作用还是不要添加了。

2) 减少接触时间:结合能力已经这么强了,适当减少接触时间加速试验是个不错的选择。

3) 更换金属离子:如果现在用的是 Ni2+,换成 Co2+离子可能可以解决问题哦。

4) 上述三点都不行的话,只能回头重新进行载体构建了,尝试减少添加的 His 数目了。

His标签纯化常见问题 3:蛋白纯度不够

His标签纯化的原理我们知道,只要蛋白中有His和金属离子都有一定的结合能力,所以呢,根据样品中杂质蛋白的不同,纯化得到的蛋白纯度一定会有差异的。我们能做的是尽量提高目的蛋白的纯度:

1)优化金属离子:纯度不够主要原因是宿主蛋白中一些含有His的天然蛋白结合在了柱子上,那么我们可以通过更换成结合能力较弱的Co2+离子,使得含有His的杂志蛋白无法结合,而标签蛋白可以结合,从而提高最终得到的蛋白的纯度。

2) 优化结合洗脱条件:寻找最适合的结合洗脱条件,将标签蛋白和杂质尽可能的分开。

3)双标签纯化:StrepII也是一个长度较小(8个氨基酸)的标签,可以在重组蛋白上同时添加His标签合StrepII标签,通过两步亲和层析,必能提高目的蛋白纯度。

4)多步纯化:通过在亲和层析之后添加凝胶过滤层析或者离子交换层析可以根据目的蛋白的大小或者带电荷等性质将其和杂质进一步的区分开,进而提高目的蛋白的纯度。

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