注册 登录  
 加关注
   显示下一条  |  关闭
温馨提示!由于新浪微博认证机制调整,您的新浪微博帐号绑定已过期,请重新绑定!立即重新绑定新浪微博》  |  关闭

美迪西生物医药

 
 
 

日志

 
 
关于我

http://www.medicilon.com.cn/

网易考拉推荐

家蚕天然膜蛋白PRMC2的分离纯化  

2017-04-20 11:15:37|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

  下载LOFTER 我的照片书  |

美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面有10余年经验积累,美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为你在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系,以提高您的目的蛋白表达水平。Email:marketing@medicilon.com.cn Web:www.medicilon.com

膜蛋白是一类结构独特的蛋白质,约占所有序列编码蛋白的1/3,膜蛋白镶嵌于膜脂的特性使这一类蛋白处于细胞与外界的交界部位,介导细胞与外界之间的信号传导,并执行很多基本的和重要的细胞生物学功能。例如,它们构成了各种神经信号分子、激素和其它45底物的受体;构成了各种离子跨膜的通道,以及构成呼吸链和转运蛋白。在目前的药物开发中,膜蛋白是研究新药的潜在靶点,有近70%的药物靶点为膜蛋白。是新药研发的重要领域之一。

常规研究的膜蛋白大部分都是原核表达后获取的,所以不具有翻译后修饰,天然蛋白具有最真实的糖基化修饰和空间结构。是最接近该蛋白的生物活性的,因此纯化天然膜蛋白具50有重要意义。

溶解是整个膜蛋白制备过程中最关键的步骤。通过溶解过程,用去垢剂将膜蛋白从它们所处的自然环境(脂膜)中提取至水溶性环境。去垢剂可以打破脂双层,并将膜蛋白和脂类包裹进去垢剂微胶束中。在去垢剂存在下,任何已知的用于水溶性蛋白的纯化技术均可用于膜蛋白的纯化。通过成功的溶解步骤可以得到稳定的蛋白质-去垢剂复合物(55蛋白质-脂类-去垢剂复合物),并且该蛋白质还要保持其具有活性时的天然构象,产率亦应较高。

简单有效的纯化方案是纯化蛋白的最佳选择,由于天然膜蛋白不具有原核表达蛋白的标签,所以在纯化时不能用到镍柱等这系列的亲和层析技术,但是亲和层析是目前蛋白质分离纯化中最高效的技术,它不仅靶向明确,而且结合率高,因此我们引入了抗体亲60和层析的技术。为我们能高效的分离纯化到目标蛋白提供了保障。

我们以家蚕杆状病毒感染的蚕蛹为材料,经过匀浆、低速离心、超速离心、密度梯度离心等一系列技术手段,获得较纯的细胞膜囊泡,然后采用含有两性离子去垢剂(CHAPS)的膜蛋白提取液从细胞膜囊泡中提取膜蛋白。利用自制的PRMC2抗体亲和层析柱初步对目的蛋白进行分离纯化,然后再利用AKTAexplorer10蛋白纯化系统的离子交换层析和凝胶65过滤层析进一步分离纯化,获得的蛋白样品最后经过双向电泳进一步分离后可以获取纯度为90%以上的高纯度蛋白,这是一种全新的有效的膜蛋白分离技术,具有重要的意义。

1材料与方法

1.1主要仪器和试剂

超速离心机购自Hitachi公司;蛋白纯化仪(AKTAexplorer10),阴离子交换柱70RESCOURCEQ1mL)和凝胶过滤层析柱(Hiload16/60Superdex75120mL)和双向电泳装置均购自GEhealthcare公司;基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪购自Waters公司。

杆状病毒感染的蚕蛹由浙江中奇生物药业股份有限公司提供;PRMC2的多克隆抗体由本实验室自制纯化,CHAPS购自Amresco公司;AminoLinkPlusImmobilizationKit购自75Thermo公司;双向电泳所用试剂购自GEhealthcare公司;TrisNaCl超纯级试剂购自Sigma公司;胰蛋白酶购自Roche公司;其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1家蚕质膜组分的制备

500g蚕蛹粉(保存于4℃)与1500mL4℃预冷)的灭菌双蒸水混合,匀浆2min80置于冰上冷却2min,共重复9次;8000rpm4℃离心60min,重复3次,以除去大颗粒杂质;所得上清15000rpm4℃离心60min,重复3次,每次4层纱布过滤,弃沉淀;然后把上清液进行0.1μm膜包超滤(料液比:1:1),重复10次,终体积恢复至样品原体积;将超滤后样品35000rpm4℃离心40min,获取含有家蚕生物膜组分的上清;把离心后的上清收集并进行蔗糖密度梯度离心:进样转数为3000rpm,从离心转头底部逐层向上铺设,依85次铺制PB溶液(150mL)、样品(350mL)20%蔗糖溶液(200mL)、30%蔗糖溶液(300mL)52%蔗糖溶液,直至溶液充满整个区带离心转头,于4℃以30000rpm离心3h,用56%蔗糖溶液下样,监视OD280并将吸收峰高的组分收集起来。

1.2.2质膜蛋白的溶解

用超滤液100kDa膜包超滤10次脱糖,终体积恢复至样品原体积,将脱糖的质膜组分90与膜蛋白提取液(含去垢剂CHAPS80mM0.5PMSF)按体积比1:2比例混合,4℃轻微搅拌8h左右。

1.2.3阴离子交换层析粗分离

600mL提取的膜蛋白样品过0.22μm滤膜后,在4℃与280mLDEAE填料手动缓慢均匀搅拌混合,每次间隔10min,共搅拌2h,然后均匀装柱,将装好的DEAE柱(柱体积95300mL)连接到AKTAexplorer10蛋白纯化系统后,用StartBuffer20mmol/LTrispH8.0)平衡至UV280nm监测线水平,采用线性梯度洗脱,洗脱液为ElutionBuffer20mmol/LTris2mol/LNaCl(pH8.0),梯度为1800mL内由0%100%。流速10mL/min,用收集管收集洗脱下的蛋白峰,15mL/管。

1.2.4免疫亲和层析中度分离

DEAE阴离子交换层析分离得到的每个峰的样品进行SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定,将鉴定正确的组分收集并用超滤管更换免疫亲和层析的Bindingbuffer。将自制的PRMC2抗体亲和层析柱平衡至室温,弃去之前的储存液,加入6mLBindingbuffer平衡柱子;待柱子平衡好后,加入含有目的蛋白的上清液,室温孵育1h,收集穿透液,加入5mLWashingbuffer洗涤非特异性结合的杂蛋白,重复5~6次;加入2mLElutionbuffer105洗脱结合的目的蛋白,收集洗脱液,用Neutralizationbuffer调节pH至中性(2mLElutionbuffer加入100μLNeutralizationbuffer,重复3~5次;加入10mLBindingbuffer平衡柱子;最后加入4mLBindingbuffer(含终浓度为0.05%的叠氮化钠),4℃保存柱子。

1.2.5凝胶过滤层析进一步分离

利用凝胶过滤层析以进一步分离免疫亲和层析得到的中度分离样品。将免疫亲和层析的110洗脱组分收集并用超滤管更换凝胶过滤层析的平衡Buffer,平衡和洗脱Buffer20mmol/LTris(pH8.0)。首先将凝胶过滤层析柱Hiload16/60Superdex75(柱体积为120mL)接入AKTAexplorer10并用平衡缓冲液平衡凝胶过滤层析柱,流速1.5mL/min,平衡2个柱体积(240mL)UV280nm监测至曲线水平;然后将免疫亲和层析的洗脱组分注入1mL上样环,上样流速1.5mL/min;洗脱时流速1mL/min,用收集管收集洗脱下的蛋白峰,1.5mL/管。115

1.2.6阴离子交换层析精细分离

对凝胶过滤层析分离得到的每个峰的样品进行SDS-PAGE电泳和Westernblotting鉴定,将鉴定正确的组分收集并利用AKTAexplorer10蛋白纯化系统进行离子交换层析精细分离。StartBuffer20mmol/LTris(pH8.0)ElutionBuffer20mmol/LTris1mol/LNaCl(pH8.0)。首先将RESCOURCEQ1mL阴离子交换柱接入AKTAexplorer10,然后用Elution120BufferStartBuffer交替平衡3次,流速2mL/minUV280监测至曲线水平;将样品注入5mL上样环,上样流速1mL/min;待未结合峰UV280监测至曲线水平后开始洗脱,采用分段梯度洗脱,流速2mL/min;用收集管收集洗脱下的蛋白峰,1mL/管。

1.2.7双向电泳检测

参照GEHealthcare双向电泳手册操作,将阴离子交换层析后的蛋白样品进行超滤除盐125并进行蛋白浓度的测定,取15μLBCA蛋白定量后的纯化样品与75μLSampleLysisBuffer90μLRehydrationBuffer充分混合,加入7cm标准型胶条槽,使样品均匀分布,将IPG胶条置于样品上,加入1mL覆盖油,设定程序如下:20℃,30V12h500V50min1000V50min5000V1.5h。开始第一向等电聚焦。待聚焦完成,取出胶条,先后放入含有1%DTT2.5%碘乙酰胺的平衡缓冲液(75mMTris-HClpH8.86MUrea29.3%甘油,2%SDS1300.002%溴酚蓝)中各振荡平衡15min。将平衡好的胶条用ddH2O冲洗两遍,与含有分子量标准蛋白质溶液的滤纸片一起转移到预制的SDS-PAGE凝胶表面,用0.5%低熔点琼脂糖封闭胶条。开始进行第二向电泳:10mV15min后转为20mA5h。溴酚蓝迁移至距凝胶底部5mm时结束电泳,考马斯亮蓝染色。

1.2.8质谱分析

从双向电泳胶上挖取蛋白点置于新的Eppendorf管内,加入500μL脱色液(100mMNH4HCO3,50%乙腈)中,室温脱色1h,弃去液相部分,重复一次;加入100μL100%乙腈,室温浸泡5min使胶块脱水;吸去残留液体,真空干燥30min去除乙腈;再加入20μLDigestionbuffer40mMNH4HCO310%乙腈)稀释的胰酶工作液(20μg/mL,4℃静置30min,37℃消化过夜。用含C18Tip头吸附多肽,溶于洗脱液(含50%乙腈,1%TFA的α-140氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液)中。取1μL样品点靶,经MAILDI-TOF质谱鉴定,获取相应蛋白的肽质量指纹图谱(PeptideMassFingerprintingPMF)并利用GPSExplorer?v3.5AppliedBiosystems)和Mascot(MatrixScience)分别对西南农大家蚕基因组数据库进行检索,获得匹配蛋白的氨基酸序列及相关信息。

 

  评论这张
 
阅读(4)| 评论(0)
推荐 转载

历史上的今天

在LOFTER的更多文章

评论

<#--最新日志,群博日志--> <#--推荐日志--> <#--引用记录--> <#--博主推荐--> <#--随机阅读--> <#--首页推荐--> <#--历史上的今天--> <#--被推荐日志--> <#--上一篇,下一篇--> <#-- 热度 --> <#-- 网易新闻广告 --> <#--右边模块结构--> <#--评论模块结构--> <#--引用模块结构--> <#--博主发起的投票-->
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

页脚

网易公司版权所有 ©1997-2018