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抗CD5单链抗体的基因构建、蛋白纯化及活性鉴定  

2017-04-20 11:16:52|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面有10余年经验积累,美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为你在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系,以提高您的目的蛋白表达水平。Email:marketing@medicilon.com.cn Web:www.medicilon.com

双特异抗体可以有效的将效应细胞富集到靶细胞周围,增强对靶细胞的杀伤,因而双特异抗体介导的免疫细胞治疗是一种很有前景的肿瘤治疗手段。CD5是一种泛T细胞(panTCell)表面标记,在双特异性抗体介导T细胞对肿瘤靶向治疗的过程中,CD5可以取代CD3FcR作为双特异抗体在T细胞表面的结合点,并消除这两者和配体交联后引发的副作用。另一方面在T淋巴细胞瘤中由于CD5的表达上调,因此CD5也被选作治疗靶点。本文拟采用基因工程手段,构建scFvanti-CD5/pET22b(+)重组质粒,原核表达重组蛋白。为构建以scFvanti-CD5为构件的双特异抗体以及免疫偶联物提供物质前提,并为其应用于肿瘤的免疫治疗提供基础。

1材料

2方法

21重组质粒的构建

211基因序列与引物设计从NCBIGenbank里查到DNA序列M90468M90467,扣除前面66bppelB信号肽序列后得到的即是anti-CD5的重链可变区VH和轻链可变区VL的序列。在VHVL之间插入linker-(G4S)3编码序列,在VH5'添加NcoⅠ酶切位点,在VL3'端添加XhoⅠ酶切位点,并在整个基因两端添加保护碱基序列,并通过Ecoli高频率简并密码子取代原始序列中的稀有密码子,设计出的目的基因scFvanti-CD5序列(共计741bp),成10条拼接引物F1-R10,以及一对扩增引物F11R11(1)

212重组质粒的构建将F1-R1010条拼接引物,温育获得基因scFvanti-CD5,温育反应条件为:95℃预变性5min95℃变性30s68℃温育2h;72℃延伸10min。加入F11R11扩增目的基因,扩增反应条件为:95℃预变性5min95℃变性30s58℃退火30s72℃延伸1min;33个循环后,72℃延伸10min,对PCR产物进行12%琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定后以NcoⅠ和XhoⅠ酶切PCR产物,回收和纯化酶切产物,在T4连接酶的作用下将其插入到经同种酶切的pET22b(+)中,获得重组质粒并转化到EcoliDH5α中。随机挑选转化子,进行菌液PCR筛选,选择PCR反应产物和理论设计值大小一致的克隆送上海Invitrogen公司测序。

22重组蛋白在Ecoli中的表达、纯化与复性将测序正确的重组质粒scFvanti-CD5/pET22b(+)转化到EcoliBL21(DE3),挑取单菌落,接种到含终浓度50μg/mL氨苄西林(Amp)LB培养液3mL中,37℃,250r/min振荡培养过夜;再按1100稀释至含终浓度50μg/mLAmpLB培养液300mL中,37℃振荡培养至A6000608;加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度01mmol/L37℃,250r/min诱导6h。包涵体溶解后的上清液,用镍亲和色谱柱纯化,操作过程参照GE公司提供的操作指南进行。纯化后的蛋白对含1%PEG400004mol/L精氨酸的100mmol/LTris缓冲液(pH87)透析复性。

23scFvanti-CD5FITC标记对01mol/L碳酸盐缓冲液透析后的scFvantiCD5,浓缩到1mL(200μg/mL),往其中加入1mg/mLFITC溶液12μL,置4℃反应4h,用超滤管4℃离心重悬数次以去除游离的荧光素,测得A280=0084A495=0100,将scFvanti-CD5-FITC均分4份,将最后一次离心得到的穿出液吸出1mL,平均分为4份。整个过程注意避光。

24流式细胞仪检测scFvanti-CD5的活性收获对数生长期的细胞,冰冷的PBS(pH74)洗涤2;4%多聚甲醛溶液重悬并室温固定30min以上,冰冷的PBS(pH74)复洗2;血球计数板计数后,调整各种细胞浓度至25×105,取细胞1mL,离心后用细胞封闭液封闭2h,用冰冷的PBS2遍,然后加入等量的scFvanti-CD5-FITC4℃避光反应12h,冰冷的PBS(pH74)洗去未结合蛋白(每步离心条件均为:4℃,1200r/min6min);洗涤5次,加入PBS1mL300目尼龙网过滤后上机检测。

25细胞膜蛋白提取

分别收集EC304CIK细胞后,冰浴超声破碎,9000r/min离心10min,去除未破裂的细胞和细胞核碎片,然后取上清,加入适量体积的solutionB43000r/min超速离心1h,即得到细胞的总膜蛋白粗提物。

26Westernblotting

取细胞总膜蛋白10μg上样,10%聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳,100mA电流半干转2h;2%BSA室温封闭2h,倾去封闭液,将硝酸纤维素膜放入干净的培养皿中,分别加封闭液稀释的scFvanti-CD5scFvanti-CD5约为5μg/mL4℃过夜;TBST3次,每次510min,加入11000稀释的HRP标记抗His-tag兔多克隆抗体,室温放置15h;TBST3次,每次510min;DAB显色。

3结果

4讨论

本研究成功地构建了scFvanti-CD5/pET22b+)重组质粒,表达的蛋白纯化复性后能够特异的识别CD5抗原。目前常用的CD5抗体多为鼠源性的完整体。这些抗体人体内反复使用可引起人体产生人抗鼠抗体反应;完整的抗体Mr大,不易穿透各种屏障;而且它们的Fc段的存在可使其与体内具有Fc受体的非特异组织细胞结合,影响其靶向效果。完整抗体的这3个缺点使之在临床的应用方面大大受到限制,而且用杂交瘤技术生产完整抗体(mAbbsAb)的成本比较高,不利于大量的制备。反观单链抗体,其免疫原性低、组织穿透能力强,不具有Fc片段,而且可以在原核系统中高效表达,克服了完整抗体的4大缺陷,因此本研究结果有着重要的意义。然而,由于单链抗体只有一个抗原结合位点,因此其结合抗原的能力较弱。本研究的实验结果也印证了这一点,流式细胞术和Westernblotting的结果信号都不是很强。通过化学交联或对单链抗体进行多聚化改造,可望增强其亲和力。

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