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大肠杆菌重组蛋白纯化方法  

2017-05-19 15:44:12|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面有10余年经验积累,美迪西生物医药拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为你在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系,以提高您的目的蛋白表达水平。Email:marketing@medicilon.com.cn web:www.medicilon.com

分子克隆构建载体的最终目的是能够将目的蛋白表达出来,常见的表达系统有大肠杆菌表达系统,酵母表达系统,昆虫细胞表达系统,植物表达系统以及哺乳动物细胞表达系统。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简单、产量高、价格低等优点,是最常用的蛋白表达系统之一。重组蛋白的分离纯化是蛋白,抗体,Elisa试剂盒研发与制备的基础。常见的纯化方法有离子交换层析,亲和层析,疏水作用层析,排阻层析,电泳等,但纯化工作不仅要保证纯度,重复性,还要保证稳定性并控制成本。以下将以E.coli表达的重组蛋白为例,给大家介绍蛋白表达成功后的纯化方法,以期对研究者蛋白纯化提供一定的参考指导。

由于E.coli表达的蛋白在某些情况下会形成包涵体,它们不溶于水,致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种情况要棘手得多,另一种情况是得到可溶蛋白。下面我们会从可溶蛋白和包涵体蛋白两个角度对E.coli重组蛋白纯化方法进行了解。

1.可溶蛋白,如果蛋白是可溶的,可直接破菌,加酶抑制剂,保证蛋白充分释放及不降解,然后选用固定化金属螯合亲和层析IMAC方法进行纯化。下图是采用IDA镍柱进行人AQO10重组蛋白纯化的电泳图:

1SDS-PAGEhumanAQO10

注:泳道1为纯化前蛋白,泳道2为流穿液,泳道3为挂柱后洗涤下来的蛋白

由图中可以看出,泳道1纯化前的样本杂带多,说明样本中所含杂蛋白多;泳道2为蛋白纯化的流穿液,杂蛋白与泳道1类似,但目标蛋白的条带更深了,这是因为目标蛋白的含量很高,洗脱下来的一些目标蛋白就占了流穿的一部分;但可以发现泳道3只有一个目标蛋白的条带,无其它杂带,表明纯化之后蛋白的纯度非常高,无杂蛋白。

2.对于包涵体蛋白,要分离包涵体、增加蛋白质的溶解度、并去除其它杂蛋白,核酸,细胞碎片,脂类等干扰,具体操作步骤原理如下:

1)菌体重悬,破菌。向菌体中加入破菌液使菌体混悬,加入TritonX-100以及EDTA,超声破碎仪破菌。Triton属于去垢剂分步洗涤中的第一步洗涤,可以洗涤掉一些脂溶性物质同时增加细胞膜的通透系,提高破碎效率,EDTA作为金属蛋白酶螯合剂存在;

2)去垢剂洗涤。这一步是为了溶解包涵体,沉淀加破菌液重悬,每管中加入TtitonX-100,可进一步去除杂质,混合均匀后离心收集沉淀;

3)高盐洗涤。这一步可去除上步残留物的干扰,沉淀加高盐缓冲液重悬,混合均匀后离心收集沉淀。同时该浓度盐可屏蔽蛋白电荷相互作用,另外可促进破碎释放的未断裂的核酸的溶解,方便后步核酸去除的处理。

4)变性剂洗涤。沉淀加TrisUrea,β-ME重悬,混合均匀后收集沉淀。低浓度变性剂urea可洗涤掉一些低表达的杂蛋白,EDTA仍作为金属蛋白酶螯合剂,β-ME作为还原剂可使高度错配的蛋白结构一定程度的舒展开。

5)变性剂溶解。沉淀悬浮于10ml的包涵体溶解液(20mMTris6MGdnHCl2mMβ-MEPH8.0)中室温静置过夜。高速离心,收集上清。高强度的变性剂使不溶性蛋白沉淀溶解,β-ME使错配的二硫键打开,促进蛋白的溶解

6)与可溶蛋白一样,采用IMAC固相金属离子亲和层析纯化变性充分的重组蛋白

2SDS-PAGEAKA4ag7854ratAPPBP2(28a)

泳道1为为流穿液,泳道2为挂柱后洗涤下来的蛋白

蛋白会通过洗脱收集验证。由图可以看出,包涵体蛋白的纯化与可溶性蛋白的纯化效率都非常高。

蛋白纯化之后,首先我们会通过SDS-PAGE对蛋白以及纯度进行一个初步验证,同时通过HPLC对纯度进一步验证,保证纯度大于95%以上。

蛋白质的纯化方法主要是利用不同蛋白质之间的相似性与差异,依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质,再根据蛋白质的差异性将目的蛋白分离出来。蛋白纯化是一项非常复杂的工作,我们提供常规E.coli表达的重组蛋白纯化方法供研究者参考。

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