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蛋白纯化标签His-Tag的优势及原理  

2018-04-24 09:14:41|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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His tag是基于蛋白质表面的组氨酸残基侧链,在中性和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子相互作用(如Ni离子,Zn离子,Co离子等),从而达到纯化蛋白的作用,它是目前常见的蛋白纯化标签之一。

1、什么是His-tag

是重组蛋白表达最常用的标签,无论表达的蛋白是可溶的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和层析(IMAC)纯化。

金属螯合亲合层析,又称固定化金属离子亲合层析(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC),是近30年发展起来的一种新型分离技术。最早由Paroth等人提出。该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸,如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理,从而对蛋白质加以分离。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合,其中以配价键结合为主,而且这其中又以6组氨酸标签(His-Tag)应用最为广泛。

以His-Tag纯化标签结合金属螯合亲合层析,为重组蛋白质的分离纯化提供了一个有力的工具。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点,上样条件可选择范围广,在高盐、一定浓度的变性剂以及去垢剂的条件下,带6His纯化标签的蛋白质都可以和亲合填料特异性结合,逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。

2、His-tag是蛋白纯化的首选标签

(1)His-Tag非常小,在融合蛋白结晶后对蛋白结构没有影响;

(2)N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容,有利于蛋白表达;

(3)采用IMAC(固定化金属离子亲合层析)纯化His-Tag融合蛋白操作更加简便;

(4)His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响,不会形成二聚体;

(5)His-Tag的免疫原性相对较低,可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体;

(6)与其它亲和标签构建成双亲和标签,并可应用于多种表达系统。

3、His-tag蛋白纯化原理    

His-tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用,包括Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+,Fe3+等,其原理是利用蛋白质表面的特性,使之被吸附在凝胶柱上,从而达到分离纯化蛋白的目的。组氨酸(His)的残基上带有1个咪唑基团,可以和Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上,这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上,因此带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上,而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱,从而得到较高纯度的 His 标签蛋白。

Ni2+在亲和纯化实验中的使用最为广泛。根据结合基团的不同,Ni2+亲和层析柱可分为Ni-IDA和Ni-NTA。NTA的颗粒粒度均匀,粒径更小,并且螯合镍更稳定,能耐受较高的还原剂,使填料更加稳定,镍离子不易脱落,因此选择Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化。

4、His标签蛋白纯化常见问题

(1)His标签蛋白不和介质结合

1)可能原因:超声功率不合适(太大,蛋白碳化,太小,蛋白没完全释放)。解决方法:改变超声功率或者其它方法破碎细胞。

2)样品或缓冲液不合适。解决方法:确保缓冲液中螯合剂,还原剂,咪唑浓度不是很高。

3)His标签暴露不完全。解决方法:在缓冲液中加变性剂(4-8M尿素,4-6M盐酸胍),然后用IMAC介质纯化。

4)His标签丢失。解决方法:必要时增加His的个数并确保正确表达,同时降低上样速度,确保足够的孵育时间。

(2)His标签蛋白结合在介质上洗脱困难

1)可能原因:洗脱条件太温和。解决方法:增加洗脱咪唑浓度或降低pH。

2)可能原因:蛋白沉积在介质上。解决方法:减少上样量,优化层析条件。

3)可能原因:非特异性结合。解决方法:缓冲液加2% Triton X-100和NaCl。

(3)洗脱峰杂质多

可能原因:非特异性结合,清洗不彻底,降解等。解决方法:纯化过程加蛋白抑制剂防止降解,上样完后要彻底清洗,加一定的NaCl和咪唑减少非特异性结合。

(4)使用几次,介质结合效率降低,柱效降低

可能原因:介质上沉积大量杂质等解决方法:彻底清洗,IDA/IMAC脱镍再生处理。

只有选择合适的纯化方法,才能得到高纯度的重组蛋白,大量纯化的重组蛋白可用于药物筛选、结构生物学研究、细胞生物学研究、蛋白质组学等的一系列生物医学领域的研究。美迪西生物医药已成功构建完整的大肠杆菌原核和酵母细胞真核的蛋白表达技术平台,并可以根据客户的需求,提供从蛋白表达质粒的构建、蛋白表达条件摸索和蛋白纯化等一整套服务。

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