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酪氨酸蛋白激酶活性分析方法  

2018-05-28 15:10:07|  分类: 酶活性检测 |  标签: |举报 |字号 订阅

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蛋白酪氨酸激酶(PTK)是控制细胞生长和分化的重要蛋白质,是在正常和异常增殖过程中起重要作用的癌蛋白和原癌蛋白家族中的成员,它在细胞癌变过程中起着至关重要的作用。因此,建立简单实用的酪氨酸蛋白激酶酶活性分析方法对于疾病早期诊断及靶向药物开发都具有重要的意义,目前我国也有不少的公司提供酶活性检测服务

蛋白激酶(ProteinKniases)作为细胞生命活动重要的信号使者,是实现细胞功能的关键调节剂之一,它构成了最大和功能最多样的基因家族之一。蛋白激酶能够参与众多生理过程,包括细胞增殖、存活、凋亡、代谢、转录以及分化等。因此,蛋白激酶被认为是治疗人类疾病,如癌症、炎症、心血管疾病或糖尿病的重要靶标。

酪氨酸蛋白激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷(ATP)与酪氨酸蛋白激酶结合的竞争性抑制剂,也可作为酪氨酸的类似物阻断表皮生长因子受体的肽位点和酪氨酸蛋白激酶的编码,抑制细胞增殖,可望开发为抗肿瘤药物,但对完整细胞没有表现出选择性。目前临床上最常用的针对BCR-ABL酪氨酸激酶小分子抑制剂(TKI)包括第一代药物伊马替尼,第二代药物达沙替尼(施达赛?)和尼罗替尼,酪氨酸激酶抑制剂主要通过抑制BCR-ABL融合蛋白,从而发挥抗白血病作用。

我国国内的研究团队基于酪氨酸酶的氧化调控机制设计了一种简单、灵敏且通用性强的荧光增强型酪氨酸蛋白激酶的活性分析方法。该方法的检测原理如下:首先针对靶标(PTK)设计合成其荧光标记的多肽底物。当体系在没有PTK存在的情况下,酪氨酸酶能够将多肽底物的酪氨酸残基氧化成邻二苯醌,进而通过电子转移机制(ET)猝灭多肽上标记的荧光基团,体系的荧光减弱。随着PTK的引入,酪氨酸残基的酚羟基被磷酸基团保护起来,从而使其不再能够被酪氨酸酶氧化,使得多肽底物保持较强的荧光信号,体系的荧光强度随PTK活性增大而增强。因此,通过测定体系的荧光信号强弱即可直观地检测PTK活性。

该设计巧妙地将酪氨酸酶对酚羟基的特异性催化氧化能力用于磷酸化和未磷酸化的酪氨酸残基的识别,同时结合氧化产物邻二苯醌可以对荧光基团产生猝灭这一现象,成功实现了简单、灵敏的荧光增强型PTK活性检测。该方法操作简单,只需要将酪氨酸酶与PTK反应体系混合后测量体系的荧光即可,大大简化了操作流程。此外,针对不同靶标PTK,合理设计相应的特异性多肽底物,可使其普遍适于不同种类PTK的活性分析。同时,该方法不仅可以用于酪氨酸蛋白激酶活性的检测,而且在药物筛选等方面也具有很好的应用前景。

    目前我国不少的医药研发外包公司提供酶活性检测服务,例如美迪西。美迪西生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验,通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等,提供一套完整的生物学服务。

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