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美迪西生物医药

 
 
 

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蛋白纯化实验室的明星标签之GST标签  

2018-05-03 09:27:04|  分类: 默认分类 |  标签: |举报 |字号 订阅

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蛋白标签是指利用DNA体外重组技术,与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。谷胱甘肽S转移酶GST是实验室常用的一种蛋白纯化标签,其本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶,能特异的与谷胱甘肽结合,表现为酶和底物的作用原理,因此可以利用这个原理,将GST做成标签表达出融合蛋白,与带谷胱甘肽配基的亲和介质特异性结合,从而纯化出目标蛋白,再用特异性的酶将GST标签切除从而得到天然蛋白。

GST标签蛋白一般应用在原核表达系统上面,一是因为它是一个高度可溶的蛋白,希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性;另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用。美迪西生物医药已成功构建完整的大肠杆菌原核和酵母细胞真核的蛋白表达技术平台,并可以根据客户的需求,提供从蛋白表达质粒的构建、蛋白表达条件摸索和蛋白纯化等一整套服务。

主要制备过程是涉及到前期样品表达和后期蛋白纯化的一个完整流程,如下所示:

1、载体的选择

带有GST标签的融合蛋白通过将特定的基因或基因片段插入到pGEX载体的多克隆位点区构建而成,融合蛋白在tac启动子的调控下被乳糖类似物IPTG诱导表达。

选择时需要注意:

(1)选择与插入片段蛋白读码框相一致的载体,避免移码突变。

(2)选择适用于目的蛋白的蛋白酶及酶切反应条件。

2、宿主

虽然多种大肠杆菌都能克隆和表达pGEX载体,但一些特殊的工程菌株能更适合表达全长的标签蛋白,产量也会更高。一些胞质蛋白酶(Lon、OmpT、DegP或HtpR)缺失的菌株能够有效保护目的蛋白不被宿主菌降解。

E.coli BL21缺失了OmpT和Lon蛋白酶,能够较高水平表达蛋白,是研究表达GST标签蛋白的推荐宿主菌株。

由于BL21转化效率较低,在克隆 扩增载体是可以使用其它菌株(如JM105),但扩增pGEX载体不能使用带有recA1等位基因的大肠杆菌。

除了大肠杆菌,噬菌体M13KO7 Helper Phage是可用于GST表达系统的M14噬菌体。

3、插入片段DNA

插入DNA片段的编码区不能超过2kb,并且插入片段的末端必须保证能与线性化的载体末端互补。定向克隆使用不同的内切酶,可以使片段插入正确的方向。

4、优化表达

这个步骤的关键是从多个克隆中筛选得到最佳的蛋白表达水平及相应的生长条件,这些条件确定之后可以进行大规模的培养。

表达条件的优化包括培养基、温度、诱导条件、通风、阳性克隆选择、包涵体控制等,而低温、增加通气性或者不同的诱导条件是最先考虑的改变项。

5、纯化

GST融合蛋白可以通过亲和层析方便地从细菌裂解物中被纯化。使用Glutathione Sehparose介质,标签蛋白与配体结合,杂质通过结合缓冲液被洗脱去除,之后标签蛋白在温和、费变性的条件下被洗脱,使得蛋白的抗原性能和功能得以保护。

6、检测

检测GST标签蛋白有多种方法,主要取决于实验条件。其中SDS-PAGE分析方法最常用与检测实验结果,但对于检测高通量筛选样品时却不推荐这种方法。

7、标签切除

如果对目标蛋白进行结构或功能研究,出去GST标签经常是必要的。对于标签的切除可以选择柱上或柱下,在洗脱后的溶液中被酶切。

蛋白纯化标签之GST在药物性肝损伤的发病机制研究

   肝脏作为人体最大的代谢器官及解毒器官,容易受到进入人体的各种药物和代谢产物的损伤。药物性肝损伤(DILI)是指由各类化学药物、生物药物、中草药及其制剂、保健品、膳食补充剂及其代谢产物等诱发肝细胞损伤坏死、肝酶异常及引起相关临床表现的疾病。药物代谢酶是药物性肝损伤相关的分子研究的主要目标,谷胱甘肽S转移酶(GST)是重要的代谢酶之一,GST在肝细胞溶质中具有高浓度,可以通过催化谷胱甘肽(GSH)与肝脏中活性代谢物的结合来降低毒性并促进尿液排泄。当肝脏严重损伤时,GST和GSH将从肝细胞质中释放到血浆中,导致肝细胞质中GST活性降低。因此,GST的基因调控对GSH代谢具有决定性作用,临床上对肝组织中GST活性水平的监测可能是诊断DILI的潜在策略。

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