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盘点pET原核蛋白质表达研究常见的问题  

2018-06-11 13:25:22|  分类: 蛋白表达与纯化 |  标签: |举报 |字号 订阅

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将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达,我国也有不少医药研发机构提供原核表达服务。在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。美迪西建立了成熟的大肠杆菌表达及纯化服务平台,提供包括各种重组蛋白以及其复合物在大肠杆菌中的表达与纯化服务。

pET 是目前应用最为广泛的原核表达系统,已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。有专家总结了使用pET系统的过程中以及原核表达中的一些常见问题,下面我们来了解一下:

1、目的蛋白总是以不可溶的形式出现

在大肠杆菌中表达的异源蛋白经常发生错误的折叠,并聚集成为包涵体。经过诱导,目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在,而多达95%(甚至更多)的蛋白则在包涵体中。实践中,有很多实验室采取降低诱导温度,例如25–30°C(Burtonetal.(1991)Prot.Exp.Purif.2,432-441),或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间,还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。随着越来越多的蛋白折叠途径被阐明,相信会出现更多有效的增加可溶性目的蛋白的实验方法。

2、所有的位点特异性蛋白酶都有一样的酶切特性,还是仅仅只是识别位点有所不同

位点特异性蛋白酶(例如凝血酶、肠激酶和Xa因子)通常被用来切割融合蛋白。这些酶的活性和第二点酶切倾向性很不相同。凝血酶在这三种中是特异性活性最高的,能够有效切质量比仅为1:2000的蛋白。Xa因子似乎对于切点周围的序列很敏感,经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位点被切割的情况。肠激酶的专一性是上述三种中最好的,但由于切割效率低(通常要求质量比达到1:10)而显得比较昂贵。另一个需要考虑的问题是:切割完成之后,是否需要去除蛋白酶。在质量比较高的酶切反应进行完后,通常要通过色谱法处理。

3、是否必须去除融合多肽或蛋白才能使目的蛋白获得活性

大多数情况下目的蛋白带有His?Tag,S?Tag?,11个氨基酸的T7?Tag?或HSV?Tag?等小肽时仍能表现出完全的活性。这些肽段相对都较为亲水,而理论上这样不会干扰蛋白的三维结构。建议首先测试蛋白活性,再看是否一定要去除前导序列才能适合特定的应用要求。

4、如果目的蛋白包含信号序列,它会不会被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在或者目的蛋白甚至可以被分泌到生长培养基中

N-端如果带有ompT或pelB这样的前导序列是使目的蛋白进入细胞周质的必要非充分条件。如果在生长培养基中发现目的蛋白的话,多半是因为细胞壁收到破坏,而并不代表蛋白是被分泌到培养基里的。穿过大肠杆菌内膜的机制还不甚了了,已经清楚了蛋白的成熟区对转运也有影响。虽然根据紧跟在信号肽序列后的目的蛋白序列可以对其输出的可能作个大概判断;但是由于蛋白的输出效率依赖于目的蛋白的特性,还是不能仅仅根据其序列来预测输出的实际情况。因此,实验中,在细胞质中发现目的蛋白(仍然带着未被切除的信号序列)或在细胞周质中有被部分加工的蛋白,在细胞周质及其它区域发现经过其它加工的蛋白,都不足为奇。某些情况下,降低诱导时的培养温度至25–30°C,可能提高输出蛋白的比率。

5、如果蛋白大于100kd或含有多个亚基,是否还能用细菌表达

在细菌中已经非常成功底表达了很多大蛋白,多亚基复合物则可以通过分别表达各亚基,然后在有尿素的溶液中,将各组分以适当比例混和,再透析去除变性剂。但是,自从Novagen的pETDuet和pACYDuet多表达载体被开发出来后,同时表达2-8个蛋白(亚基)变得十分容易了。

6、基因是否对大肠杆菌有毒

某个蛋白不是所谓“毒素”并不意味它就不会杀死大肠杆菌或显著降低其生长水平。虽然有些种类的蛋白由于显而易见的原因很容易被认为是毒素(例如,可以与DNA或干扰电子转移);而其它的蛋白(例如一些重组抗体)有毒则并不明显或不易预期。如果试图在一个有“渗漏”表达的系统中克隆和表达蛋白而遭遇失败,基本可以认为目的蛋白对大肠杆菌有毒性。因此,对于一种新的基因的研究,基本的原则之一即是尝试多种pET载体/宿主菌组合,以期掌握最佳表达途径。

7. 如果IPTG诱导后细胞停止了生长,是不是表示细胞死了

T7 RNA聚合酶非常活跃,T7转录和翻译信号极强,因此,一旦诱导,细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下,细胞将停止生长,形成克隆的能力大大降低,但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。也有一些例外情况,例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体/宿主菌组合 (比如含有pLysE的宿主菌)等,这时在诱导后菌落还是会继续生长。

8. 除了毒性和降解,还有哪些因素会影响目的蛋白的表达水平?

(1)、mRNA转录子中的二级结构会干扰AUG翻译起始密码子和/或核糖体结合位点。如果发现表达很差,可以通过检查编码插入序列的链上的与上述序列互补的序列,以确定是否是因为存在潜在的二级结构造成麻烦。

(2)、 目的基因中稀有密码子比较多也是常见的表达水平低的原因,如果稀有密码子集中出现在氨基端情况更为严重。应该注意,跟据现有对大肠杆菌高表达的基因研究发现的有限的稀有密码子,已经观察到由于其对应的tRNAs水平很低,直接导致了翻译延伸的困难。

(3)、序列中的意外的终止密码子可能造成突变,这在PCR克隆产物的情况下较为突出。可以通过测序发现此类问题,也可以用体外翻译的方法确认重组子的表达能力,可以选用Novagen的Red Nova 溶菌液进行测试。

9、 有时除了全长目的蛋白以外,还能看到截短的产物

出现这种情况一个最直接原因就是蛋白水解了,然而第二点翻译起始也非常有可能。起始密码子AUG (Met) 的上游在RNA编码区有类似于核糖体结合位点序列(AAGGAGG)的间隔序列(通常是5–13个核苷酸)时,容易出现这种问题。截短蛋白在纯化全长蛋白的操作时往往造成麻烦。解决途径之一即是选用两端都带有融合标签的pET载体,例如pET-28和pET-30系列载体在N-端和C-端都有HisTag。这样,全长蛋白就可以通过提高咪唑浓度,在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。pET-29和pET-30系列载体在N-端融合有HiSTag序列而C-有HisTag,因此可以先后用固定化S-蛋白和His Bind树脂亲和纯化以获取全长蛋白。

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