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浅析几种常见的PCR技术  

2018-06-29 14:36:18|  分类: 生物技术 |  标签: |举报 |字号 订阅

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PCR是聚合酶链式反应的简称,是一种将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法。PCR技术发展至今已被广泛应用于生物学基础研究、物种鉴定、精准医疗、微生物检测等多个领域,PCR技术服务也成为常见的分子生物学服务之一,分子生物学是从分子水平上阐明遗传、生殖、生长和发育等生命特征的分子机理,从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新手段

目前分子生物学在现代医学检验中,主要有聚合酶链式反应(PCR)、分子生物传感器、分子生物芯片技术、分子生物纳米技术、分子蛋白质组学5项应用。分子生物学已经成为现代医学领域不可或缺的诊疗手段之一,为疾病的诊治提供了科学的技术保障,给患者带来了很大的福音。美迪西在分子生物学、细胞生物学、体外生物学、结构生物学等生物学领域经验丰富,可以通过酶水平、细胞水平测定等技术平台帮助客户进行化合物筛选及化合物特性、作用机制及生物标记物分析等研究,保证了客户项目的有力实施,帮助客户推进药物研发的进程。

PCR技术作为一种常用的分子生物学技术,目前已经成为人们获得目标基因的最常用的方法之一。PCR技术的基本原理并不复杂,主要包括模板DNA(目标DNA)加热变性;降温后反应混合物中特异性引物与单链DNA模板的复性;72℃条件下,Taq酶诱导引物借助模板信息由5’端到3’端延伸。每一轮反应,模板拷贝数都增加一倍,理论上n次循环后,扩增产物拷贝数为2n-1。常见的PCR技术主要有以下几种:

1、原位PCR( in situ PCR)技术

原位杂交细胞定位和PCR技术的有机结合,在组织或细胞水平直接对靶基因片段进行扩增,通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测。

原位PCR综合了PCR 和原位杂交ISH的优点,是一种在组织切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行扩增,再用特异性的探针原位杂交检测。细胞膜和核膜有一定的通透性,PCR扩增所需的各种成分可进入细胞内或核内,在原位对特定的DNA或RNA进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织,不易透过细胞膜向外弥散,故保留在原位。

原位PCR技术是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。它既能分辩带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究肿瘤的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。

2、锚定PCR(Anchored PCR,APCR)技术

原理:用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。应用:它可用于扩增未知或全知序列,如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

3、不对称PCR(asymmetric PCR)技术

两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50~100:1比例。在最初的10~15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。

应用:可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。

4、反转录PCR(reverse transcription,RT- PCR)技术

当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT-PCR应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

5、等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR,ASPCR)技术

ASPCR依赖于引物3’- 端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。

6、复合PCR(multiplex PCR)技术

原理:在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。

应用:复合PCR主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

7、重组PCR技术

重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

8、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术

这个也是大家非常熟悉的方法了,qPCR可用于研究基因表达,能提供特定DNA基因表达水平的变化,在癌症、代谢紊乱及自身免疫性疾病的诊断和分析中很有价值。

9、竞争性PCR(competitive PCR,c-PCR)技术

c-PCR技术是竞争cDNA模板与目的cDNA同时扩增,使用同样的引物,但一经扩增后,能从这些目的cDNA区别开来。通常使用突变性竞争cDNA模板,其序列与目的cDNA序列相同,不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点。这种方法能精确测定mRNA中cDNA靶序列,可用于几个到10个细胞中mRNA的定量。

10、巢式PCR(NEST PCR)技术

    先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。

    PCR技术在分子生物学领域已有四十多年的历史,得益于全世界生命科学家对该技术的大量研究。在今后随着分子生物学的不断进步,PCR技术将会更多的造福医学研究。

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