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蛋白质组学实验技术之酵母双杂交系统  

2018-07-11 13:07:45|  分类: 蛋白质组学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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蛋白质组学(Proteomics)是系统生物学的有机组成部分,是指利用高分辨的蛋白质分离技术和高效的蛋白质鉴定技术在蛋白质水平上整体性、动态和定量地研究生命现象及规律的科学,蛋白质组学服务也是一些医药行业服务商提供的服务之一。酵母双杂交技术作为研宄蛋白质相互作用的主要方法,在规模化蛋白质相互作用研究中占据举足轻重的地位。

蛋白质组是空间和时间上动态变化着的整体,一个基因组对应多个蛋白质组。相比稳定的基因组,蛋白质组是遗传信息、环境因素、生活习惯等多因素的综合体现。蛋白质组学的建立为研究蛋白质水平的生命活动开辟了更为广阔的前景,提供了新型有效的研究手段。

蛋白组学的发展离不开其相关实验技术的突飞猛进,这些技术不仅可以进行蛋白质的分离和鉴定,还可以进行目的蛋白的筛选和样品的分析,为生命科学领域相关研究提供了新的思路和解决办法。美迪西蛋白质组学技术服务整合了生物化学、细胞生物学、分子生物学与质谱等多项技术,能够实现蛋白鉴定、差异蛋白定量分析、复合物分离、蛋白翻译后修饰(如:磷酸化、糖基化、泛素化等)的解析及蛋白质组信息学分析。

酵母双杂交系统是一种较为简便、灵敏和高效的,在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统。美迪西提供酵母双杂交服务,具有独立优质实验室,专业实验人员,提供详细的酵母双杂交实验步骤、原始数据和图片、结果分析,可以出具权威检测数据报告。

酵母双杂交系统利用真核细胞调控转录起始过程中,DNA结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(action domain,AD)启动所调节的基因的转录这一原理,将已知蛋白X和待研究蛋白Y的基因分别与编码AD和BD的序列结合,通过载体质粒转入同一酵母细胞中表达,生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用,则AD和BD在空间上接近就能形成完整的有活性的转录因子,进而启动转录,表达相应的报告基因;反之,如果X和Y之间不存在相互作用,报告基因就不会表达。这样,通过报告基因的表达与否,便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。

1、酵母双杂交技术的特点及应用

该方法在研究蛋白质相互作用方面具有诸多优点:

(1)酵母双杂交杂交系统以生长速度较快的酵母作为报道菌株,具有转化方法简单、效率较高的特点,而且对许多微弱或短暂的蛋白质相互作用具有较高的敏感度,可借助报告基因在表达过程中的多级放大效应反映出来;

(2)因融合蛋白之间的相互作用在真核酵母活细胞内进行,这样蛋白质经过翻译后修饰,可能保持天然的空间构象和折叠状态,更接近细胞内的真实情况,多种营养缺陷标记易于筛选,使试验结果更加真实可靠。

但是该技术也存在许多问题,例如依赖于翻译后修饰的蛋白质相互作用一般不适用此方法,因为激活报告基因的相互作用的蛋白质必须定位于核内,而且假阳性及假阴性问题也不可忽视。有研究者指出在试验中酵母双杂交实验最关键的步骤是酵母培养时间的掌控,因此酵母培养时间的控制是酵母双杂交实验成功的关键。

为了对这种技术进行比较和优化,有研究者做了一系列试验,证明3次酵母双杂交法就可以检测出一组标准互作蛋白集的78%,而进行第4次检测更是可以将结果提升到83%,说明多次酵母双杂交试验足以检测出系统中大部分相互作用蛋白。该方法目前在蛋白质相互研究中应用广泛,不仅可以检验已知蛋白质之间的相互作用甚至微弱短暂的作用,还可以从cDNA文库中筛选靶蛋白的相互作用蛋白。

通过建立蛋白相互作用图谱,可用于确定基因治疗中多肽类药物的作用靶点。酵母双杂交系统的许多相关研究方法与技术也已得到了改进和完善,目前以衍生出单杂交系统、三杂交系统、核外双杂交系统、反向双杂交系统、哺乳动物双杂交系统等,为蛋白质组研究提供了丰富的技术平台。

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