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浅析蛋白质组学样品的制备  

2018-07-13 13:07:56|  分类: 蛋白质组学 |  标签: |举报 |字号 订阅

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蛋白质组学是指研究细胞、组织或生物体蛋白质组的组成及其变化规律的科学,目前蛋白质组学研究正日益成为现代生物学中的研究热点。蛋白质组学技术服务结合基因组学、代谢学等生命组学研究技术,来挖掘多层次分子信息,同时应用现代遗传技术、分子影像技术、生物信息技术,结合患者生活环境和临床数据,可以实现精准的疾病分类和诊断,制定出具有个性化的疾病预防和诊疗方案。因此蛋白质组学不仅在早期诊断方面,还在在疾病预防、分型、疗效监测、判断预后等诸多方面都有着巨大的潜力。

蛋白质组样品的制备是蛋白质组学研究的基本技术之一,也是蛋白质组学研究的首要步骤,该技术要求尽可能完整地将所有的蛋白质从细胞或者组织中提取出来。蛋白质学样品制备的基本原则是:

1、蛋白质学样品制备的基本原则

(1)样品处理尽量简单,减少蛋白损失;

(2)尽量避免蛋白的降解;

(3)尽可能提高样品蛋白的溶解度;

(4)防止溶液介质中对蛋白质的人为修饰;

(5)去除非蛋白杂质。

2、制备过程

蛋白质的制备一般要经过4个阶段:选择材料和预处理,材料的破碎,提取和纯化,浓缩、干燥和保存。由于蛋白种类繁多,性质差异较大,因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。根据性质进行分类,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。

浅析蛋白质组学样品的制备 - 美迪西 - 美迪西生物医药

 

3、制备原理

蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异,主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例,其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。

(1)温度

多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大,因此,温度高利于溶解,缩短提取时间。但另一方面,温度升高会使蛋白质变性失活,因此,基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温(5度以下)操作。

(2)pH值

蛋白质、酶是具有等电点的两性电解质,提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时,应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化,从而导致蛋白质构象的不可逆变化,一般来说,碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

(3)离子强度

稀浓度可促进蛋白质的溶解,称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点,因此在提取液中加入少量 NaCl等中性盐,一般以0.15摩尔为宜,缓冲液常会采用 0.02-0.05M 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用,将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要的物质分开。

4、制备方法

破碎的方法有许多种,可归纳为:

(1)机械法(超声波法、机械匀浆法、液氮研磨法和玻璃珠破碎法);

(2)化学法(去污剂法、酶裂解法);

(3)物理法(循环冻融法、渗透法、高压法)。

这些方法有不同的应用范围,基本的原则都是要以最小的限度减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解变性,这也就是在样品制备破碎这一步的关键所在。而常用的方法有:超声波法、机械匀浆法、液氮研磨法、盐析、沉淀法。其中,有机溶剂沉淀法使用较为普遍,常用的有机溶剂有丙酮、苯酚等。

有机溶剂沉淀法的优缺点

    优点:

(1)分辨能力高,即一种蛋白质或其他溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀;

(2)根据实验要求选择最合适的溶剂可以使实验尽可能准确;

(3)成本较低。

缺点:容易引起蛋白质变性失活,操作常需在低温下进行。且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。

 

冷丙酮沉淀和苯酚提取方法的优缺点

 

提取方法

优点

缺点

冷丙酮提取

操作简单,适合一般蛋白的提取

容易使蛋白变性,杂质较多的蛋白提取效果较差

苯酚的提取

适合杂质较多的蛋白样本,需求样本量少

操作过程较繁琐,耗时长

 

丙酮和苯酚沉淀法注意事项:

冷丙酮沉淀

(1)冷丙酮沉淀的时间与温度;

常温或升温时,蛋白立体结构展开,丙酮极容易与其中的色氨酸、酪氨酸等氨基酸进行疏水结合导致蛋白变性,所以我们通常预冷丙酮并且低温操作;

(2)超声功率和时间,重在观察超声后样品溶性的均匀度;

(3)一般和三氯乙酸一起使用,效果更好;

(4)还原烷基化。

苯酚提取

(1)各种试剂的正确及精确配制(如:煎糖提取液);

(2)加入饱和酚后要充分震荡和离心(使蛋白充分与酚、色素H键结合,让其分三层);

(3)需纯化蛋白(甲醇、TCA/冷丙酮去色素、苯酚等杂质)。

美迪西的蛋白质组学技术服务整合了生物化学、细胞生物学、分子生物学与质谱等多项技术,能够实现蛋白鉴定、差异蛋白定量分析、复合物分离、蛋白翻译后修饰(如:磷酸化、糖基化、泛素化等)的解析及蛋白质组信息学分析。
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