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美迪西生物医药

 
 
 

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重组蛋白分离纯化技术之亲和层析  

2018-07-17 09:06:27|  分类: 蛋白表达与纯化 |  标签: |举报 |字号 订阅

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在细胞的提取物中,除了目标蛋白外,还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中,重组蛋白纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离,并得到一定的量,达到一定的纯度,同时要尽可能保留蛋白的生物活性,并使蛋白保持完整。简言之,重组蛋白纯化就是利用不同蛋白质之间的相似性与差异,依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质,在根据蛋白的差异性将目的蛋白分离出来。

亲和层析法是近年来广为重视并得到迅速发展的提纯、分离方法之一。许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性。例如:酶与辅酶或酶与底物(产物或竞争性抑制剂等)、抗原与抗体、凝集素与受体、维生素与结合蛋白、凝集素与多糖(或糖蛋白、细胞表面受体)、核酸与互补链(或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白)以及细胞与细胞表面特异蛋白(或凝集素)等。美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富,拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物质可逆性特异结合的化合物(称配体)连接到某种固相载体上,并将载有配体的固相载体装柱,当待提纯的生物大分子通过此层析柱时,此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上,其他物质则被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分离并洗脱下来,从而达到分离提纯的目的。亲和层析技术主要有以下3种:

1、生物特异亲和层析

生物特异亲和层析以生物分子作为配体,可分为免疫亲和层析、凝集素亲和层析和核酸亲和层析等,另外还有以酶、粘附蛋白、受体蛋白或底物为配体的亲和层析。生物特异亲和层析法包括免疫亲和层析、凝集素亲和层析、核酸亲和层析等,另外还有以酶或底物为配基的亲和层析或以粘附蛋白或受体蛋白为配基的亲和层析,其特点是配基为生物分子。

2、人工配体亲和层析

人工配体亲和层析也称为通用配体亲和层析,是指利用一类人工配体对不同的蛋白质有亲和性的特点,通过亲和层析来纯化这些蛋白质的方法。主要包括金属螯合亲和层析和染料配体亲和层析等。

3、金属螯合亲和层析

金属螯合亲和层析也称固相化金属离子亲和层析,是利用固定金属离子螯合剂(如IDA 和NTA)螯合二价金属离子(如Ni2+、Zn2+、Cu2+和Co2+等),再与蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基(组氨酸、色氨酸、赖氨酸等)相互作用而进行的亲和纯化。金属螯合亲和层析具有配体简单、通用性强、分离条件温和、吸附量大等优点。Ueda等应用Ni 离子亲和层析,并结合分子筛层析,分离得到大肠杆菌表达的人催乳素,其纯度达到99.5%。

4、染料亲和层析

染料亲和层析是1968年由Haeekel和oppersehlager分别偶然发现的,他们发现蓝染料和磷酸化激酶有专一性作用,并成功地应用于纯化酵母中磷酸激酶。染料配体亲和层析具有蛋白结合容量大,是天然配基蛋白质结合量的10一100倍,配基偶联方法简单,易于操作,蛋白质洗脱容易,适于大规模应用。

层析技术应用于蛋白质的分离纯化开始于60年代,现在已成为重组蛋白纯化的高分辨的方法。亲和层析基于蛋白质和亲和配体的特异性相互作用,是最为高效的分离纯化方法,用于亲和层析的配体可以是针对抗原的抗体、针对蛋白质分子的受体、酶的底物或抑制剂、针对糖分子的凝集素、活性染料、金属离子、天然或改造过的相互作用多肽等等。利用DNA重组技术,进行目标蛋白的融合表达,再用亲和层析进行分离纯化,已经成为蛋白质表达纯化的常用手段。

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