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美迪西生物医药

 
 
 

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盘点那些常用的融合标签  

2018-07-19 14:31:38|  分类: 蛋白表达与纯化 |  标签: |举报 |字号 订阅

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融合标签技术是20世纪末兴起的一种基因重组技术,其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3'端或5'端融合某种标签的编码基因,通过适宜的宿主来表达重组蛋白质,表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。因此该项技术也常被应用在一些医药研发外包服务公司提供的重组蛋白表达服务中,融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。

蛋白融合即在蛋白序列上加上蛋白标签,蛋白标签是指利用DNA重组技术与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或蛋白质,以便于目的蛋白的表达、检测以及纯化。美迪西生物医药在重组蛋白表达服务方面经验丰富,拥有多种蛋白表达系统,包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统(杆状病毒)哺乳动物细胞蛋白表达系统,具备多种融合技术,可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

融合标签根据其分子量大小可分为两大类:大的蛋白质分子(或蛋白质结构域及其衍生物)和小的多肽片段。大的蛋白质标签有SPA(葡萄球菌蛋白A)和GFP(绿色荧光蛋白)、GST(谷胱甘肽巯基转移酶)等,它的使用会增加目标蛋白的溶解性,但在蛋白结晶和抗体产生等过程中,标签必须去除。

小的多肽标签有6×His(六聚组氨酸)、HA(流感病毒血凝素表位)、c-myc(人c-myc蛋白表位)、FLAG(专为蛋白纯化和检测设计的八肽)等,多数情况下,由于多肽标签相对较小,对融合蛋白质结构影响小,不需要从融合蛋白质中切除,因而多肽标签较蛋白质标签更为常用。

1、SPA(葡萄球菌蛋白A)

葡萄球菌蛋白A (SPA) 是金黄色葡萄球菌细胞壁的表面蛋白质,由于SPA具有能与多种动物IgG 的Fc片段结合的特性,因而成为免疫检测技术中的一种极为有用的试剂。如SPA放射免疫分析、SPA免疫酶标记技术、SPA荧光检测技术等。还有研究表明单个胶体金标记的金黄色葡萄球菌A蛋白分子具有独特、稳定、均一的特征性构象,可以作为原子力显微术观测的原位标记物。

2、GFP(绿色荧光蛋白)

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP) 是一种能够自身催化形成发色结构,并在488nm激光激发下发出绿色荧光的报告基因,GFP的发现及其研究发展迅速,使得人们能够在正常生活条件下对活细胞内分子水平上进行的各种过程及其分子机理进行观察和研究。研究表明,GFP能在多种生物,如细菌、酵母、植物及哺乳动物中表达且产生可见荧光,因此有着很高的应用价值。

3、谷胱甘肽巯基转移酶 GST

GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶,它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个,一个是因为它是一个高度可溶的蛋白,希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性;另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达,起到提高表达量的作用。

GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达,可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下,融合蛋白在水溶液中是可溶的,并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测,该标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和树脂进行纯化。

4、His6标签

His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用,一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力,可用于固定化金属螯合层析(IMAC),对重组蛋白进行分离纯化。

5、HA(流感病毒血凝素表位)

    HA标签蛋白,标签序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇,9个氨基酸,对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti-HA抗体检测和ELISA检测。

HA标签来源于人类流感血凝素的98-106位氨基酸,具很强的免疫反应性,被广泛用于HA融合目的蛋白的分离、纯化、检测和示踪。重组的HA标签蛋白可以使用偶联有HA高特异性单克隆抗体的树脂来完成高效纯化。

6、c-myc(人c-myc蛋白表位)

c-myc基因是myc基因家族的重要成员之一,c-myc基因既是一种可易位基因,又是一种多种物质调节的可调节基因,也是一种可使细胞无限增殖,获永生化功能,促进细胞分裂的基因,myc基因参于细胞凋零。

c-myc基因与多种肿瘤发生发展有关。C-Myc标签蛋白,是一个含11个氨基酸的小标签,标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu,这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

7、FLAG(专为蛋白纯化和检测设计的八肽)

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK),同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。Flag标签可位于蛋白质的C端或N端,该系统已广泛应用于各种细胞类型,包括细菌、酵母和哺乳动物细胞等,相应的Flag标签抗体也被广泛应用。

近年来,越来越多的科学家运用融合标签的技术来研究蛋白质,融合标签技术的快速发展也给蛋白的表达纯化带来福音。

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