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美迪西生物医药

 
 
 

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酵母双杂交技术可用于筛选LKB1相互作用的蛋白  

2018-07-26 10:35:15|  分类: 酵母双杂交 |  标签: |举报 |字号 订阅

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众所周知蛋白质在细胞生命活动过程中起着非常关键的作用,对蛋白质相互作用的认识可以更好地理解生命的本质,酵母双杂交系统是体内分析蛋白质间相互作用的一种有效的遗传学方法。在一些生物医药公司提供的酵母双杂交实验服务中,客户只需要提供诱饵基因信息,便可以根据客户对指定的基因文库进行酵母双杂交筛选,筛选完成后向客户提供详细的筛选报告和阳性克隆实物。

酵母双杂交系统操作是在核酸水平上进行,是在酵母细胞内研究蛋白质间的相互作用,并且还能检测到蛋白质间微弱的相互作用,无需对蛋白质进行纯化,因此自从该技术建立以后,得到了迅速广泛的应用。美迪西生物医药提供酵母双杂交实验服务,它拥有独立优质实验室和专业实验人员,可以出具权威检测数据报告,提供详细的酵母双杂交实验步骤、原始数据和图片、结果分析。

LKB1是一种肿瘤抑制蛋白,全名是肝脏激酶B1(liver kinase B1),能控制细胞生长和代谢。在动物模型里研究人员们发现,失去LKB1功能的小鼠会出现致命的炎症反应。进一步的病理分析确认,这些小鼠的脾脏和淋巴结肿胀,多个器官内有浸润的免疫细胞。这些现象表明,能抑制免疫反应的调节性T细胞出了问题。

1、LKB1与T细胞的关系

为了检验这个想法,研究人员们进一步分析了这些小鼠内的调节性T细胞。他们发现,这些细胞无论从功能上,还是从分子水平上,都彰显出了功能性衰竭的特点。研究人员将这个发现与LKB1的功能联系了起来——敲除LKB1后,那些对线粒体的功能至关重要的代谢通路收到了干扰,从而影响到了调节性T细胞的活性和功能。

LKB1不仅能影响到调节性T细胞本身的健康状况,还会影响到在肿瘤免疫疗法中起了重要作用的分子——PD-1。在分析敲除LKB1前后,调节性T细胞表达的分子差异时,研究人员们意外地发现,在缺乏LKB1的调节性T细胞内,PD-1分子的表达有所上升,这进一步抑制了调节性T细胞的免疫抑制能力,让小鼠体内出现了狂乱的免疫反应。通过抑制PD-1,小鼠体内的调节性T细胞活性有明显恢复,致命的免疫反应也得到了控制。这说明PD-1也能抑制调节性T细胞的功能

2、应用酵母双杂交技术筛选与LKB1相互作用的蛋白

应用酵母双杂交技术可筛选与抑癌基因LKB1发生相互作用的蛋白,方法是应用酵母双杂交系统,以人LKB1为诱饵,筛选人类全基因组开放阅读框酵母双杂交文库,寻找能与之相互作用的蛋白,并且通过免疫共沉淀和GST-Pull down实验证实其之间的相互作用。

结果:经过酵母双杂交共获得17个克隆,经过验证分析最终确定1个无重复阳性克隆。结论:获得的1个基因编码的蛋白可能揭示LKB1新的作用机制。

3、大规模酵母双杂交筛选方法

(1)文库筛选法

文库筛选法一般用相对较少的已知或未知诱饵去筛选相对较大猎物库,也可以在诱饵筛选出阳性猎物后,再以猎物为诱饵筛库,如此循环,不断扩大图谱。诱饵可以一个或数个至数千个,可以是ORF、全长cDNA或它们的片段(含结构域);猎物库一般很大,可以是众多ORF集合成的库,也可以是全长cDNA库或cDNA片段库,或随机基因组片段库。文库筛选法优点是可以得到相互作用的结构域信息和降低假阴性率,但同时也可能提高假阳性率。

(2)阵列筛选法

阵列筛选法又可分为一对一阵列、高通量阵列法、亚库对亚库法。一对一阵列法含有不同BD-X 的菌株和所有含不同 AD-Y的菌株一一对应筛选。

一对一队列法:所有含不同DBD-X的菌株和所含不同AD-Y的菌株一一对应筛选。这种筛选方法工作量大,但阳性克隆可从阵列位置推出序列信息而不需测序,可自动化,且理论上检测出蛋白质所有相互作用的可能性大。

高通量阵列法:是把所有不同 ORF-AD 集合成库, 然后与排成阵列的不同DBD-X 作用的筛选方法, 其实质是诱饵数量较大情况下的阵列化文库筛选。优点是有较高通量,但需测序鉴定阳性克隆。

亚库对亚库法:把总数较大的DBD-X和AD-Y的成员分别编号并分组,每组含一定数量的成员,然后集合每组成员形成亚库,再用猎物亚库对诱饵亚库一一作用,筛选阳性克隆。此法在酵母基因组的ORF筛选中比高通量阵列法还高通量,但对阳性克隆的猎物和诱饵都需测序鉴定。

(3)两步法

两步法结合文库筛选和阵列筛选,发挥二者优势。先以单个猎物对诱饵亚库筛选,然后把阳性克隆对应的猎物再同其作用的诱饵亚库的诱饵一对一作用以筛选阳性克隆。如研究者对胎脑蛋白相互作用研究采用此法,优点相当于验证一次表型,同时不需测序,减少了工作量、耗材和费用。

酵母双杂交系统是在真核细胞内从基因水平分析蛋白与蛋白间相互作用的一种灵敏而有效的方法,此技术已经在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并揭示了大量未知蛋白间的相互作用。

 

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