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浅析影响毕赤酵母表达的环境因素  

2018-07-09 08:57:44|  分类: 蛋白表达与纯化 |  标签: |举报 |字号 订阅

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目前基因工程有四大表达系统,即酵母表达系统、杆状病毒载体表达系统、大肠杆菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统,美迪西生物医药拥有这四种表达系统。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有独特的优势,是一种异源蛋白表达的理想系统。

外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达,除受目的基因本身影响之外,还受培养温度、pH、培养基成分、通气量、蛋白酶的降解、甲醇诱导的浓度和诱导时间等这些外在条件的印象。。

1、培养条件诱导温度

培养条件诱导温度对酵母自身的生长和外源蛋白的表达量有重大影响。巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白适宜的温度在28℃~30℃之间,温度达到32℃时所有的蛋白表达都会停止。在这一温度范围内酵母生长最快,容易达到高密度,而重组蛋白表达量与菌体密度理论上呈正相关。

此外在酵母生长或高量表达时会释放处大量的热量,因此整个发酵过程中进行温度的调节、热交换、加热、冷却装置都是必不可少的。一般情况下,毕赤酵母表达的最适温度是30 ℃,但不排除特殊蛋白质的特殊表达条件。研究表明在诱导温度为20℃时,毕赤酵母表达干扰素α的表达量比30℃时提高7.2 倍,且生物活性提高38.7 倍。

2、pH值

毕赤酵母表达外源产物最合适pH 通常是3.0~8.0,诱导时培养基的pH 可以影响外源蛋白的表达量或品质,一方面通过pH 值影响蛋白酶活性来改善蛋白产物的降解,从而提高蛋白产物的表达量;另一方面通过向培养基加入考马酸、EDTA、YP,等成分可提高分泌蛋白的稳定性。通过降低诱导培养基pH,向培养基配方中增加少量EDTA 和水解酪氨酸,降低诱导温度至25℃的表达条件优化,虽然酵母菌向培养基分泌的总蛋白有一定降低,但全长rhA20 所占比例明显提高,产量为优化前的11 倍。

3、通气量

巴斯德毕赤酵母利用甲醇时需要消耗大量的氧气,溶氧不足会限制菌体增殖,并且造成甲醇及其代谢物甲醛和过氧化氢的累积,对酵母产生毒性。因此充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达极其重要,通常发酵过程中提高氧饱和度可以提高蛋白表达量。

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4、甲醇诱导的浓度

甲醇既是巴斯德毕赤酵母的诱导物又是碳源,它的浓度直接影响细胞的生长和蛋白质的表达。一般甲醇的添加量为0.5 %~1%,外源蛋白随甲醇浓度的升高(< 3 %)表达量也提高。甲醇浓度太高会对细胞产生毒性,浓度太低诱导表达量少,因此诱导表达时需对甲醇浓度进行控制。摇瓶诱导表达过程中以限制性流加的方式补甲醇,使甲醇的消耗与补料处于动态平衡状态。

5、甲醇诱导时间

甲醇诱导时间也是影响因素之一,诱导时间多在3 d~5 d之间,时间过短表达量低,时间过长则蛋白易降解,因此需要根据载体特点和蛋白质性质优化诱导时间以获得最大表达量。在巴斯德毕赤酵母表达的突变型人白细胞介素-2 的发酵条件中,甲醇浓度为1%,诱导时间2d 时,表达产物达高峰为0.204g/ L。

近年来,随着现代分子生物学的快速发展,通过基因工程技术获得重组的功能蛋白,成为进行蛋白质结构功能研究、抗体制备、疫苗及药用蛋白的生产的重要途径。巴斯得毕赤酵母作为一种异源蛋白表达系统,具有操作简便、成本低廉、表达量高、产物便于分离纯化等优点。同时还具备对目的蛋白质进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰功能,使表达的重组蛋白具有同天然蛋白相似的生物学功能,因此被广泛用于医药领域和学术研究。美迪西科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台,提供重组蛋白在毕赤酵母和酿酒酵母中的表达与纯化服务。

 

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